基于代谢组学技术的肺癌早期诊断标志物研究进展

刘一潼，卢婧懿，于翰喆，董超，魏斌斌

（中国医科大学药学院，辽宁 沈阳 110021）

肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，新发病率和死亡率多年来都居于各类癌症之首，其中85%的肺癌都是非小细胞癌（NSCLC）。肺癌的高隐匿性是造成其高死亡率的最主要原因，因此为肺癌的早期诊断和病理分期寻求高效可靠的检测方法是十分必要的［1］。由于不同肺癌患者体内癌细胞的扩散程度和肿瘤的发展趋势不同，可将肺癌进行分期，即0期、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或者Ⅳ期（晚期）。对于不同分期、不同种类的肺癌，分别有相应的治疗方法和手段，如手术疗法、化学疗法、放射疗法以及化学辐射的综合疗法等。近年来，除了上述传统治疗方法以外，又出现了一些治疗效果显著的新疗法，如靶向治疗、免疫治疗。目前，在临床治疗上，根据疾病的复杂性多以联合治疗为主。但是由于恶性肿瘤的特殊性和医疗条件的受限，以往临床上虽多采用手术与辅助化疗方法，其治疗效果往往难以令人满意，很难控制肺癌患者的五年生存率。因此，针对肺癌的早期诊断和有效的新型治疗方法的开发研究十分重要。

代谢组学是对某一生物或者细胞的所有小分子量代谢产物进行定性和定量分析的一种技术手段，其借助高通量技术如核磁共振波谱法（NMR）或质谱法等来鉴定代谢物和代谢循环。当机体处于病理生理状态时，细胞中的代谢产物也会发生性质和数量上的变化，代谢组学因而可应用于疾病诊断。代谢组学可根据是否对代谢物具有针对性（或对整个代谢组的不偏向性）分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学［1］。根据所研究内源性代谢物质的分布可将代谢组学分为：细胞代谢组学、呼吸代谢组学、尿液代谢组学、血液代谢组学和组织代谢组学等。

生物标志物是一种可衡量疾病发生或存在程度的指标，可用于疾病筛查、诊断、定性和监测；用于开发个性化的治疗干预措施；用于预测治疗反应等。同时具有可以在各种生物材料中（如血液、器官组织、粪便、唾液和尿液）检测的优点。因此，生物标志物检测类似于药物的开发阶段，可以为临床应用提供理论基础［2］。本文将从血液、呼吸、细胞、尿液、组织代谢组学五方面阐述代谢组学技术在肺癌早期诊断的生物标志物研究中的应用。

1 细胞代谢组学

有研究发现，肿瘤的发生发展与生物体糖酵解代谢及三羧酸循环代谢等代谢过程异常高度相关［3］。细胞在氧气充足的条件下，通过大量摄取葡萄糖生成乳酸，激活相关信号通路并改变肿瘤微环境。在糖酵解代谢过程中，有许多调控代谢的相关蛋白质在调控细胞凋亡的发生，如甘氨酸脱羧酶（GLDC）诱导糖酵解和甘氨酸/丝氨酸代谢的剧烈变化，导致嘧啶代谢的变化，以调节癌细胞的增殖。在临床中，GLDC 异常激活与肺癌患者生存期较差相关，在多种癌症类型中均可观察到GLDC 的异常表达［4］。某些调控细胞凋亡的蛋白质也在代谢通路中发挥着信使作用，即糖酵解通路中甘氨酸的代谢和肿瘤发生之间的这种联系可能为抗癌治疗提供新的靶点。孙海超等［3］通过基于气相色谱/质谱联用（GC/MS）的代谢组学技术分析多西他赛（抗肿瘤药物）处理和未处理的A549 和H1299 细胞，发现处理后8 种代谢物发生显著变化，其中三羧酸循环关键调控酶即异柠檬酸脱氢酶显著下调，表明多西他赛诱导NSCLC细胞凋亡可能与三羧酸循环代谢途径抑制有关。Chen等［5］采用固相微萃取、热解吸结合气相色谱作为检测系统，分别检测不同类型的肺癌细胞、支气管上皮细胞、味蕾细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种靶细胞培养基中挥发性有机化合物（VOCs）的含量，发现4 种特殊的VOCs，它们是肺癌细胞的代谢产物，可作为肺癌早期检测的生物标志物。Wang等［6］对多组试验对象的呼出气进行VOCs分析，并对3种肺癌细胞和18例肺癌患者的组织进行体外培养，对培养物顶部空间VOCs进行分析，发现23种VOCs为肺癌的VOCs生物标志物，得到了可以通过呼吸诊断肺癌的直接证据，为肺癌的诊断提供了一种新颖、无创和快速的方法。

综上所述，通过分析细胞代谢物分泌情况的差异表达进而寻找可能的肺癌生物标志物是具有科学依据且具有发展前景的便捷可行的新手段。细胞层面的相关检测在与传统以患者血液、尿液和组织为样本的代谢组学研究相互佐证和补充后，为研究肺癌的发病机制、预防和治疗提供新思路和新方法［7］。

2 呼吸代谢组学

反映肺癌发病机制的生物标志物的另一种可能来源是呼出气体冷凝物（EBC）——一种生物液体和呼吸道的天然基质［8］。DNA、RNA、蛋白质、代谢物和VOCs 等分子存在于EBC 中，它们的存在与否或浓度的变化可作为早期诊断肺癌的代谢组学生物标志物。Peralbo-Molina等［9］将EBC用作临床样本，从2 个对照组（有和没有危险因素）中开发肺癌鉴别的筛查工具，使用PanelomiX工具配置3 个代谢物组，以最小化假阴性（特异性）和假阳性（敏感性），5种代谢物的组合导致3个组的敏感性高于77.9%，特异性高于67.5%，曲线下面积（AUC）高于77.5%，还发现与肺癌患者相比，单硬脂酸在危险因素个体中的相对浓度较低。同时，从一个由积极吸烟者和前吸烟者组成的危险因素组和另一个对照组由健康的非吸烟者组成2个对照组的对照实验中开发了一种可用于肺癌早期诊断筛查工具，利用GC-TOF/MS分析，建立了基于代谢组的预测模型，包括烟草、单酰基甘油衍生物和脂肪酸甲酯等相关化合物，以区分肺癌患者和对照组，强调了它们在早期检测肺癌的潜在适用性。

3 尿液代谢组学

泌尿生物标志物不仅在泌尿生殖道的器官中，还在其他器官，例如乳房、卵巢和大脑中，都可显示癌症。作为机体的重要代谢物，尿液是一种重要的非侵入性收集的生物肽，是肺癌潜在生物标志物的来源。有研究指出，泌尿生物标志物会快速解决癌症治疗中现有的诊断和预后缺陷，研究已经确定了金属元素、特定蛋白质、蛋白质特征、荧光峰比、非挥发性代谢物、外体蛋白和烟草代谢物在肺癌患者尿液中的差异［10-11］。有研究表明，新的生物标志物，包括蛋白质和代谢物，可以预测癌症的风险和治疗后复发［12-13］。尿液有很多独特的优点，跟血液不同，它的分子活性在取样后变化不大，是相对干净的介质，它含有很少的干扰蛋白，并且它适应非侵入性采样。尿液通过侵入性较小的手段比血液数量大，允许反复取样与测量。到目前为止，已有100多种挥发性泌尿生物标志物与癌症有关，其中肺癌相关尿代谢物是肌酸核苷、N-乙酰氨基氨酸（NANA）、硫酸皮质醇和不确定代谢物561+，这些代谢物在肺癌诊断之前在受试者的尿液样本中升高［14］。同时，相关新的检测技术也应用广泛，近年来，An等［15］将亲和层析色谱结合LC-MS/MS用于肺癌尿液代谢组学研究，并取得很好的进展。

4 血液代谢组学

因为肺癌导致代谢的变化，患者体内血液中的某些物质（如氨基酸、核酸等）的含量与平衡往往与健康人群有所差异。血液中的代谢物作为所有细胞代谢过程的产物，对疾病条件和环境变化有着较高的敏感度与特异性，代表所有器官生理功能的终末产物，形成对个体当前生理状态的详细系统表征［16］。

Kumar 等［17］基于GC-TOF-MS 的血浆和血清样本的非靶向代谢组学研究，从41例肺癌病例和41例对照受试者中收集血液样本，以确定重要的代谢物以及发现肺癌的血浆和血清生物标志物，结果显示，在血浆样品中发现了27 种差异代谢物（BH调整后的P<0.05），并在肺癌的血清样品中发现了13 种差异代谢物（BH 调整的P<0.05），同时获得了3个重要途径：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径；（2）牛磺酸和次牛磺酸代谢途径；（3）来自血浆样品的丙酮酸代谢途径。在通路分析和代谢组学相关性网络分析的基础上，得出4个代谢物牛磺酸、阿斯珀酸、谷氨酰胺和丙酮酸为血浆生物标志物，3个代谢物天冬氨酸、牛磺酸和肌苷作为肺癌的血清生物标志物。在这些代谢物中，牛磺酸、冬氨酸和丙酮酸在癌症患者中上调，谷氨酰胺和肌苷下调。

Fahrmann等［18］收集血清和血浆用于ADC1与ADC2两组独立的病例对照研究（ADC1中有52例NSCLC腺癌病例和31例对照组，ADC2中有43例NSCLC 腺癌病例和43例对照组），采用GC-TOF/MS对2组病例进行代谢组学检测研究，研究结果表明NSCLC腺癌患者中多种循环代谢物显著升高或降低，体现了代谢组学在发现和验证诊断NSCLC 腺癌的候选生物标志物方面的应用和有效性，在一定程度上确定了个体代谢物和多代谢物组对于肺癌早期筛查诊断的作用。

5 组织代谢组学

与血液标本相比，组织标本受外界因素影响较小，组织代谢物代表的是不同组织和器官的总体变化水平，通过比较代谢物在肺癌组织中与在癌旁组织中的含量变化，进而比较该代谢物的含量在组织中是否一致。

余江清等［19］通过冷冻保存的肺癌组织及正常组织，分析筛选出脂质、乳酸和甜菜碱为肺癌组织与正常肺组织间的差异代谢物。Jordan 等［20］对肺癌患者和健康人的肺组织进行分析，发现在肺癌组织中葡萄糖、肌醇和乙酸的浓度下降，而乳酸、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的浓度升高。陈文学等［21］利用高分辨魔角旋转核磁共振（HRMAS 1HNMR）技术，对肺癌患者不同部位的组织萃取液进行代谢组学分析，报道了12例肺癌组织中代谢物的变化差异，发现相比于邻近非侵入肺组织，肺癌组织中乳酸含量显著升高，而肌醇、谷氨酰胺和缬氨酸的含量显著下降。Wu 等［22］利用丹磺酰衍生化和液相色谱/质谱（LC/MS）方法，用于分析肿瘤和正常肺组织中大量含胺或酚的代谢物的变化，可作为肿瘤标志物。

然而，组织作为临床上诊断肺癌的金标准，由于获取较困难，不利于作为肺癌早期筛查手段进行推广，在后续的研究中应将其结果与其他样本代谢组学结果结合使用，相互验证，从而探索敏感性高、特异性强的肺癌早期诊断生物标志物。

综上所述，代谢组学研究作为一门新兴学科，能够辅助疾病的早期诊断，从代谢水平发现疾病的标志物，继而为临床诊断提供参考。如今科学技术飞速发展，将代谢组学和其他组学（基因组学、转录组学、蛋白质组学等）相结合，从而建立完善且可靠的肺癌生物标志物数据库，有利于提升对肺癌系统生物学的认识，从而能够更完整地揭示肺癌生物调控网络的复杂性。