NF-κB信号通路在椎间盘退行性变中的机制研究探讨

叶嘉杰，姚啸生，戚晓楠，郑浩，于红卫，路翀

（1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110079；2.辽宁中医药大学附属医院）

下腰痛（low back pain，LBP）是一种常见疾病，全世界约有6.37 亿人受到影响。流行病学调查表明，下腰痛已经成为严重的医疗和社会问题，也是导致残疾最常见的原因之一。据统计，大约80%的人群在一生中的某个时期会经历腰痛，大约18%的人群随时都可能遭受腰痛困扰［1-2］。现代研究发现，椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration，IDD） 是LBP 的主要诱因，同时是其他脊柱疾病，如椎间盘突出、脊椎病和腰椎狭窄的先期改变。IDD 是衰老过程的正常组成部分，其典型的特征是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）稳态受到干扰，因此基质合成代谢减少，分解代谢增加，椎间盘细胞外基质丢失［3］。有研究表明，IDD 与椎间盘组织中促炎细胞因子水平的升高有关，如白细胞介素（IL）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）［4］。

近年来，这些介导因子在IDD 中的基因表达和功能一直是研究的热点。此外，在骨关节炎和类风湿性关节炎等领域的广泛治疗研究强调了识别潜在信号通路的必要性，促使大量IDD 研究人员探索导致IDD 炎症和分解代谢的分子机制。核因子κB-（NF-κB）作为一种主要的细胞内通路，它可能在IDD 的发生和发展中起重要作用。本文总结了椎间盘中NF-κB 信号通路不同的激活机制以及NF-κB 可能的靶基因，对NF-κB 信号通路在IDD中机制研究进行探讨。

1 LDD的相关表现

IDD 的发展以椎间盘微环境的细胞和生化改变为特征，导致进行性的功能和结构损害。椎间盘的机械功能由ECM提供，主要的机械作用是由胶原纤维和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）提供的。胶原纤维主要由I型和II型胶原纤维组成，其主要为椎间盘提供了抗拉强度。Aggrecan 是椎间盘的主要蛋白聚糖，通过其组成成分软骨素和硫酸角蛋白链提供的渗透压来维持组织水化［5］。

在健康椎间盘中，由于生长因子和分解代谢因子的复杂调控，ECM 的合成速率和分解速率是平衡的。当ECM分解超过其合成时，通常会发生IDD［6］。胶原蛋白和蛋白多糖的丢失在IDD的发展中起着关键作用，而基质金属蛋白酶（MMPs）、新型金属蛋白酶ADAMTSs 是分解胶原和蛋白聚糖的主要酶［7］。许多MMPs 和ADAMTSs 成员在IDD 组织和细胞中高表达，这些酶与ECM 破裂和IDD 进展密切相关［8］。随着胶原成分的改变，髓核水分丢失，引起纤维环和终板的损伤，IDD 使促炎介质的产生，细胞衰老和死亡的增加，健康椎间盘细胞表型的改变，以及活跃细胞数量的减少，IDD由此产生。

2 NF-κB的结构和功能

2.1 NF-κB 的成员 在哺乳动物中，NF-κB 转录因 子 系 列 由NFKB1、NFKB2、RELA、REL和RELB编码的五个成员P50、P52、P65（Rela）、c-Rel 和Relb 通过一个N 端DNA 结合/二聚结构域（称为Rel 同源结构域）相互关联［9］，其中最丰富的是p50：p65 异源二聚体，它控制着大多数NFκB上调基因的表达［10］。

2.2 NF-κB的抑制与激活 DNA结合NF-κB二聚体的活性被称为IKB 亚基的附属蛋白紧密控制。IκB在非刺激细胞的胞浆中保留NF-κB二聚体，并形成一个小家族，包括经典的IκBα、IκBβ、IκBε和非典型的BCL-3（B cell CLL/lymphoma 3），IκBζ，和IκBNS［11］。在大多数静息细胞中，胞质抑制分子IκBα、β 和ε 以及前体P100 和P105 抑制活性NF-κB 的释放，同时IkB 蛋白抑制DNA 结合并阻止NF-κB复合物的核转移［12］。

许多不同的刺激可以激活NF-κB 转录因子来诱导其向细胞核聚集。大多数刺激激活的是经典的NF-κB 信号通路，主要影响的是p65：p50 和c-Rel：p50异二聚体。该通路围绕着三聚体IκB激酶（IKK）复合物的激活。IKK 复合物包括两个催化亚基IKKα 和IKKβ 以及一个称为IKKγ 或NEMO（NF-κB Essential Modator） 的 调 节 亚 单 位 组成［11］。在各种刺激下，IKK 激活使IκB 磷酸化并导致其泛素化和随后被泛素化蛋白酶体降解。IκB的降解使NF-κB 二聚体能够移位到细胞核以诱导基因表达。由于NF-κB 本身还激活IκB 本身的表达，所以NF-κB 活化通常是瞬时的，持续大约在30～60 min［13］。

3 IDD中相关因素与NF-κB的激活

之前的研究已经证明了NF-κB 与退行性疾病的密切关系，如骨关节炎或骨质疏松症。研究发现炎症因子和氧化应激水平升高导致的NF-κB 活化；促炎因子水平升高致使NF-κB 活化导致IDD，而抑制NF-κB可以减缓IDD［14-15］。

3.1 IDD 中的炎症因子与NF-κB 炎症反应的不断进行致使IDD 是目前的主流观点之一。目前研究表明，与IDD 相关的主要致炎介质包括IL-1β、TNF-α、IFN-γ、PGE2等，以及一些不同的趋化因子［14］。在这些炎症反应进程中，TNF-α和IL-1β的大量表达被认为是IDD 的关键，同时这两个因子也是NF-κB激活的主要炎症因子［4，15］。

3.1.1 IL-1β 激活NF-κB 信号通路的途径 IL-1β的激活需要炎症小体（NLRP）促进caspase-1 激活，然后将前体proIL-1β 裂解成mIL-1β 和IL-1βN端肽［16］。IL-1β通过激活IL-1β受体产生作用。IL-1β 受体是异二聚体复合物，由IL-1 受体辅助蛋白（IL-1RACP）和IL-1 受体类型I（IL-1RI）组成。在信号转导过程中，IL-1RI 细胞外免疫球蛋白结构域与IL-1β 结合，形成专有的异源二聚体。然后，TIR 结构域招募IL-1RACP 形成IL-1β/IL-1RI/IL-1RACP配合物。该复合物结合衔接蛋白、髓样分化因子88（MYD88），募集IL-1R 相关激酶4（IRAK4）之后，IRAK1由IRAK4磷酸化，随后与TRAF6相互作用［17］。TRAF6激活转化生长因子-β-活 化 激 酶1 （TAK1） 和TAK1 结 合 蛋 白2（TAB2），进而影响IKKα 和IKKβ，从而导致NFκB的核转移［18］。

3.1.2 TNF-α激活NF-κB信号通路的途径 TNF-α主要以跨膜型TNF-α（tmTNF-α）的形式产生。此外还有部分tmTNF-α 由金属蛋白酶TNF-α 转换酶（TACE）裂解成sTNF-α（可溶性形式）。TNF-α通过两种不同的受体发挥作用：肿瘤坏死因子受体1（TNFR1，又称p55）和肿瘤坏死因子受体2（TNFR2，又称p75）。TNFR1 可被tmTNF-α 或sTNF-α激活，而TNFR2 主要由tmTNF-α 激活［19］。其中TNFR1 是肿瘤坏死因子-α 信号转导的核心调节因子，在大多数细胞类型中都有组成型表达。

在tmTNF-α和sTNF-α刺激下，TNFR1从起抑制作用的SODD（silencer of death domain）蛋白中分离出来，TNFR1 可以结合TNF 受体相关死亡结构域（TRADD），并募集其他适配器蛋白质，包括TNF 受体相关因子2（TRAF2），受体相互作用蛋白-1 （RIP-1），细胞凋亡抑制蛋白1（CIAP1）和CIAP2形成复合体I［19-21］。随后复合体I通过招募MEKK-3 并介导IKK 的激活，促进NFκB核转位，导致多个靶基因的转录。TNFR2胞内区没有死亡结构域，因此不能与TRADD结合。但是，它可以直接与TRAF2相互作用以招募TRAF3、TRAF1、cIAP1和cIAP2［22］。因此，TNFR2和TNFR1具有共同的信号效应，使NF-κB的激活。

3.2 IDD 中的缺氧适应性反应与NF-κB 椎间盘细胞生物学最重要的一个方面是，髓核细胞和内部纤维环内的细胞在血液供应中被移除。起源于椎体的血管穿过终板的浅表区域，这些血管均未渗入髓核。因此，髓核细胞处于无血管、缺氧的组织生态位［5］。有研究报道缺氧有助于炎症的发展，至少部分是通过激活或增强NF-κB 这种参与先天免疫、炎症和凋亡的细胞信号通路［23］。椎间盘髓核细胞对缺氧的适应性反应受缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α调节。此外，HIF-1α和HIF-2α的水平主要受氧依赖的蛋白酶体降解控制，并由HIF的脯氨酸4-羟化酶结构域（PHD）家族的蛋白质催化［24］。

缺氧是IDD 的微环境特征之一，可通过多种方式影响炎症的进展。HIF和NF-κB是两种低氧应答转录因子，它们控制着适应基因和炎症基因的独立队列，表现出高度的依赖关系。在慢性炎症疾病中，组织缺氧导致PHD 活性降低，随后激活HIF依赖的适应性基因表达。炎症配体的信号传导导致NF-κB 活化和随后的炎症和抗凋亡基因表达。两种通路之间广泛的交叉作用也存在，包括NF-κB依赖的HIF-1αmRNA表达上调，HIF依赖的NF-κB 活性调控及HIF-羟化酶对NF-κB 信号传导的调控［25］。

3.3 IDD 中的氧化应激与NF-κB 退变性椎间盘的微环境以酸性pH、低营养、高渗透压和炎症为特征［26］。髓核细胞处于缺氧但不是完全厌氧的微环境中。髓核细胞对低氧微环境的适应能力较好，仍具有一定的氧化代谢水平。然而，伴有新生血管形成的退变性椎间盘的特征是氧张力增加，同时高氧伴随的是髓核细胞中线粒体源活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激和线粒体功能障碍，进而导致髓核细胞过度凋亡、衰老和ECM降解［27］。

根据目前的研究，退变椎间盘中ROS 的过量产生导致的氧化应激与NF-κB 途径的激活息息相关。在线粒体ROS 触发的分子机制中，NLRP3 炎症小体因其在IDD 中的有害作用而被广泛研究。NLRP3炎症体的激活可以增加IL-1β的产生，会导致NF-κB 信号通路的激活与线粒体功能障碍，线粒体功能障碍又会加剧线粒体ROS和NLRP3炎性小体的激活［28］。Feng 等［29］通过对大鼠髓核细胞研究发现，Nox4，一种ROS 的生成酶，属于NADPH 氧化酶（Nox）家族，在椎间盘中因高氧而大量表达，产生大量ROS，并可通过NF-κB 信号通路诱导髓核细胞的基质降解和炎症的表达。Yao 等［30］发现高糖（HG）抑制剂可以抑制HG 诱导的ROS/NF-κB 途径造成的机体髓核细胞损伤和ECM降解。

3.4 IDD 中的衰老与NF-κB 衰老与椎间盘的一系列退行性改变密切相关，衰老的椎间盘细胞是不可逆的细胞周期阻滞，由于细胞凋亡或坏死，导致功能性和活性椎间盘细胞数量的逐渐减少，最终纤维环破裂和椎间盘高度降低等［3］。基质蛋白多糖（PG）的丢失是椎间盘生物力学功能所必需的主要结构成分，也是椎间盘老化的另一个普遍特征。一项模拟研究发现，NF-κB 是与哺乳动物衰老最相关的转录因子，并证明NF-κB 效应器的一个子集的表达随着年龄的增长而增加［31］。Nasto 等［32］在老化的椎间盘组织中发现了相比正常椎间盘升高的NF-κB 活性，敲除了NF-κB 亚基p65 等位基因的小鼠椎间盘细胞内PG 含量较未退变的椎间盘细胞有所增加，加入IKK 抑制剂8KNBD后发现作用与基因敲除类似，PG合成量较未处理的显著增加，提示IKK/NF-κB 信号通路在老化引起IDD中起重要作用。

4 IDD中NF-κB的靶基因

目前已知在人体中有超过150个基因受NF-κB调控，其中包括几种炎症介质，如TNF-α、IL-1β、IL-6、（COX-2）、MMPs 和黏附分子等［33］。但在椎间盘中的靶基因还尚未完全可知。

IDD中有症状的椎间盘特征是炎症因子水平升高，这些炎症因子被认为是典型的NF-κB靶基因，例如TNF-α、IL-1β等［34］。同时有些炎症因子也是NF-κB的活化因素，从而构建了一个正反馈回路。

Wang 等［8］总结了高表达的MMP 家族可能在促进IDD 的进展中发挥重要作用，其中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9 和MMP13 已经被鉴定为IDD 过程中的NF-κB 靶基因。ADAMTS 是一种新发现的金属蛋白酶家族，ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS- 5、 ADAMTS- 7、 ADAMTS- 12 和ADAMTS-15 在IDD 组织中的表达明显高于非退行性组织［35］。ADAMTS-4和ADAMTS-5因其高效裂解蛋白聚糖而被普遍认为是IDD 的主要侵袭性酶，并且认为其依赖于NF-κB 通路［36］。椎间盘中的iNOS/NO 和COX-2/PGE2 系统激活的信号通路被证明是ROS依赖的NF-κB通路，NO和PGE2均能抑制髓核细胞中aggrecan的合成，从而导致IDD中ECM的破坏［37］。

除了对ECM 相关蛋白酶的调控，NF-κB 还靶向一些细胞因子发挥调控作用。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），一种巨噬细胞的趋化因子，在小鼠IDD 细胞中的表达受到NF-κB 途径的调节［38］。Gu 等［39］对椎间盘髓核细胞的体外研究发现内毒素引起的NF-κB 核转移，诱导促炎细胞因子释放，从而促进细胞因子TGF-β 的活化。此外，抵抗素通过NF-κB信号通路与TLR4结合，上调趋化因子配体4（CCl4）在髓核细胞中的表达，导致巨噬细胞浸润［40］。

在IDD 中活化NF-κB 还可能促进多种凋亡调节因子的表达，如凋亡调节因子P53 和其下游BH3-Only Bcl-2 家族成员凋亡调节因子（PUMA）都与NF-κB密切相关［41-42］。

5 小结与展望

随着人口老龄化的加剧，IDD 必将成为现在乃至将来的热点问题。IDD 一直是骨科重点研究方向，根据现有的国内外文献研究，NF-κB 通路的研究是具有科研和临床实践价值的。NF-κB 可由椎间盘内多种因素（包括炎症因子、缺氧、氧化应激和衰老等）激活，同时我们也总结了IDD中NF-κB 的靶基因（包括炎症因子、ECM 相关蛋白酶、免疫因子以及凋亡相关基因等）。

通过靶基因研究，我们可以得到IDD 中的某些病理生理变化是由NF-κB 信号通路所介导的。此外，通过椎间盘内NF-κB 激活途径的研究可以帮助我们找到抑制NF-κB 通路激活的关键环节，从而开发具有特异性NF-κB 信号抑制剂或者通过调控NF-κB 上游激活因素来达到对NF-κB 的抑制作用，对于预防和治疗IDD 具有重要意义。我们对于NF-κB 通路的基础研究还需进一步深入，未来药物学研究以及生物分子调控将被用于IDD，相信更好的疗效及更低的副作用的手段将帮我们更好地应对IDD的发生。