盐水连续浇灌下107份黄花苜蓿苗期耐盐性评价

张 磊, 王玉祥, 李瑞强, 楼明祝, 陈映霞, 张志杰, 张 博

(西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室 新疆草地资源与生态重点实验室 新疆农业大学草业学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

土壤盐渍化、淡水短缺对农牧业主产、生态环境以及可持续发展的威胁是一个世界性的问题[1]。我国农业灌溉用水量约占总供应水量的62%，在西北干旱、半干旱地区，尤其是新疆，灌溉用水的短缺已成为限制农业持久发展的重要因素。开发利用盐水资源以增加灌溉水源已经成为了我国西北地区解决水资源危机的一项重要措施[2-3]。土壤中盐离子含量过高会会对植物产生渗透胁迫、离子毒害和氧化胁迫。并对植物的种子萌发、根长、株高、结实等方面抑制显著[4]。选育种植耐盐牧草是节约灌溉用水与缓解土壤盐渍化的重要的方法[5]。

黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)是一种豆科多年生牧草，抗逆性强，并且可以与紫花苜蓿和兰花苜蓿等天然杂交，是优秀的育种材料[6]。目前关于黄花苜蓿耐盐性的研究较少，吕世杰[7]试验表明脯氨酸、可溶性糖和丙二醛可以作为鉴定黄花苜蓿耐盐性的指标，叶绿素不能作为鉴定指标；田雨等[8]通过测定不同浓度NaCl胁迫下黄花苜蓿的生长特性，认为锡盟黄花苜蓿耐盐性较强；武祎等[9]研究了中性盐和碱性盐对黄花苜蓿种子萌发的影响，认为碱性盐的胁迫作用大于中性盐，但黄花苜蓿盐胁迫和高pH有一定的耐受性；秦峰梅等[10]测定不同NaCl浓度下黄花苜蓿的发芽率、发芽指数等指标，认为黄花苜蓿耐盐性强于紫花苜蓿。王俊杰[6]测定了不同浓度的NaCl胁迫下，37个野生黄花苜蓿居群的成活率、株高和地上生物量等指标，并进行筛选出了耐盐品种。已有的研究主要集中于黄花苜蓿单盐胁迫下的生理和生长指标变化，而关于利用自然环境下淡化盐水进行复合盐胁迫的研究相对较少。本研究使用新疆达坂城盐湖水稀释液连续浇灌107份国内外黄花苜蓿种质，通过测定盐胁迫对形态指标、光合指标和生理指标的影响，并应用综合分析法对供试材料的耐盐性及耐盐性相关指标进行综合评价，以期为黄花苜蓿耐盐性评价及耐盐性苜蓿育种提供理论和材料基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以国内外的107份野生黄花苜蓿种质作为试验材料，种子均由新疆农业大学草业学院和西部干旱区草地资源与生态教育部重点实验室提供，表1所示。

表1 供试黄花苜蓿种质材料编号及来源Table 1 Number and origin of yellow alfalfa germplasms used in this study

续表1

1.2 试验方法

试验于2020年6月在新疆农业大学三坪试验基地进行。选择颗粒饱满、大小均一的黄花苜蓿种子，用刀片划破表皮，破除种子硬实。使用塑料花盆(上内径12 cm、下内径10 cm、高12 cm)种植，每盆装干燥花土0.5 kg，按50∶1的比例施基肥。每盆播种5粒，播种20盆。每天光照16 h(光照强度6 680 Lux)，温度为22℃±1℃；黑暗8 h，温度18℃±1℃，保持湿度55%±10%。出苗15 d后间苗至每盆1株，出苗30 d后刈割至2 cm，再生长15 d后按照长势平均分为对照组和实验组。

实验组处理液为电导率为10 mS·cm-1的新疆达坂城盐湖水稀释液(氨氮：0.44 mg·L-1，总磷：0.19 mg·L-1，总氮：0.99 mg·L-1，pH=6.5)，每4 d处理一次，每次浇灌300 ml，对照组浇灌自来水。试验于50 d(处理12次)后结束，测定其形态、光合及生理指标。

1.3 测定内容及方法

1.3.1形态指标测定 试验第52 d测定最终形态指标，采取常规测量法测定株高(Plant height，PH)、幅长(Plant length，PL)、幅宽(Plant wide，PW)、茎粗(Stem diameter，SD)；齐地刈割地上部分，用清水清洗后擦干，称量鲜重(Fresh weight，FW)；使用LA-S3000型叶面积仪测量植物全叶面积(Whole leaf area，LA)；最后用纸包住放入烘箱，105℃杀青45 min，恒温70℃过夜后称量干重(Dry weight，DW)。

1.3.2SPAD值与叶绿素荧光测定 试验第53 d中午11：00至15：00测定SPAD值与叶绿素荧光数据，使用SPAD502叶绿素含量测定仪测量每盆植株固定叶片(倒2叶)的SPAD值，测定5次后计算平均值；使用PEA植物效率分析仪测定每盆植株固定叶片(倒2叶)的叶绿素荧光参数(Fo/Fm，Fv/Fm和Fv/Fo)，重复3次。

1.3.3生理指标测定 试验第54 d进行取样，分别从对照组和实验组称取新鲜叶片1 g，重复3次，取样后迅速用锡箔纸包裹后放于液氮中备用。采用茚三酮测法测定叶片脯氨酸(Proline，Pro)含量；采用硫代巴比妥酸法测定叶片丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量；采用蒽酮比色法测定叶片可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量。

1.4 数据分析

使用Excel 2019进行基本数据的统计与处理处理，使用SPSS 26.0进行相关性分析、主成分分析、隶属函数分析及聚类分析，使用DPS 9.01进行灰色关联度分析。对供试材料进行耐盐排序并筛选耐盐性鉴定关键指标。

1.4.1抗性指数 以抗性指数来评价不同材料间的抗性，某项测定指标的抗性指数(α)的计算：

(1)

1.4.2权重 使用主成分分析后因子载荷计算各主成分权重：

(2)

1.4.3隶属函数值及耐盐度量值(D值) 为减少不同指标间的差异，使用各材料主成分得分进行隶属度的计算：

(3)

式中：X(β)是某一份材料隶属度值；Xi是某一指标的主成分得分的平均值；Xmin为该主成分得分最小值； Xmax为该指主成分得分最大值。

(4)

式中：D代表耐盐性度量值，n代表指标数。

1.4.4灰色关联度 依照公式(5)将各指标的隶属函数值进行累加求其平均值。参照耿慧等[11]的方法，对原始数据进行无量纲化处理，以隶属函数值作为参考数列，各指标作为比较数列，进行灰色关联度分析。

(5)

式中Xt表示隶属度平均值，n表示指标数。

关联系数和关联度的计算公式为：

(6)

(7)

式中，Ψi(k)为关联系数，ri为灰色关联度。|x0(k)-xi(k)|表示参考数列与比较数列间的绝对差值，minimink|x0(k)-xi(k)|为二级最小差值，maximaxk|x0(k)-xi(k)|为二级最大差值。ρ为分辨系数，本实验中取值为0.5[12]。

2 结果分析

2.1 盐胁迫对各指标的影响

通过公式(1)计算供试材料各指标抗性指数，并对各指标对照组和实验组的平均值进行独立样本T检验。在盐水连续浇灌下，可溶性糖差异不显著，SPAD在P<0.05水平下存在显著差异，其余指标皆在P<0.01水平下存在显著差异(表2)。

表2 供试材料指标的测定及差异分析Table 2 Measurement and difference analysis of tested materials

2.2 盐胁迫下各指标抗性指数的相关性分析

将盐胁迫下14个指标抗性指数进行相关性分析(图1)，结果表明：株高与鲜重、干重、SPAD呈正显著相关(P<0.05)；幅长与幅宽、鲜重、干重、茎粗、全叶面积呈极显著正相关(P<0.01)，与Fv/Fo呈显著正相关；幅宽与鲜重、干重、全叶面积呈极显著正相关，与可溶性糖呈极显著负相关；鲜重与干重、茎粗、全叶面积、Fv/Fo呈极显著正相关，与Fv/Fm呈显著正相关；干重与茎粗、全叶面积、Fv/Fo呈极显著正相关，与Fv/Fm呈显著正相关，与Fo/Fm呈显著负相关；全叶面积与丙二醛、Fv/Fo呈显著正相关；SPAD与丙二醛呈显著负相关；脯氨酸与可溶性糖呈极显著负相关；丙二醛与Fo/Fm呈极显著正相关，与Fv/Fm呈极显著负相关，与Fv/Fo呈显著负相关；可溶性糖与Fo/Fm呈显著正相关，与Fv/Fm、Fv/Fo呈显著负相关；Fo/Fm与Fv/Fm、Fv/Fo呈极显著负相关；Fv/Fm与Fv/Fo呈极显著正相关。

图1 盐胁迫下各指标抗性指数的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of each index resistance index under salt stress

2.3 各指标抗性指数主成分分析

对14个指标的抗性指数进行主成分分析，获得因子载荷和贡献率。表3可知：前4个主成分(Principal component，PC)累计贡献率达83.28%，基本可以代表供试材料14个指标的绝大部分信息。在第1主成分中(PC1)，鲜重、干重、幅长、全叶面积与幅宽具有较高的因子载荷，分别为0.855，0.829，0.733，0.710和0.690；在第2主成分中(PC2)，Fo/Fm、Fv/Fm和Fv/Fo有较高的因子载荷，分别为0.768，-0.761和-0.720；在第3主成分中(PC3)，脯氨酸和可溶性糖具有较高的因子载荷，为-0.774和0.675；在第4主成分中(PC4)，SPAD具有较高的因子载荷，为-0.814。

表3 主成分分析因子载荷及权重Table 3 Principal component analysis factor loading and weight

2.4 隶属函数值及耐盐性度量值(D值)

通过计算各主成分特征向量，获取供试材料主成分得分，使用公式(3)计算各主成分的隶属函数值，使用公式(4)计算供试材料的耐盐性度量值(表4)。其中耐盐性排在前5的材料是：84，48，97，39，47；耐盐性排在倒5的材料是：21，57，59，65，100。

表4 供试材料隶属函数值及耐盐性度量值Table 4 Subordinative funcation and D value of tested materials

2.5 聚类分析

以材料耐盐性度量值为基础，使用瓦尔德法对107份材料的耐盐性进行聚类分析[13]，分为6个类群，并根据其耐盐性度量值划分为：极强(Extremely strong)、强(Strong)、较强(Generally strong)、较弱(Generally weak)、弱(Weak)和极弱(Extremely weak)。

其中类群I为耐盐性极强的材料，包括10份材料，占总材料数的9.35%，平均D值为0.718；类群II为耐盐性强的材料，包括15份材料，占总材料数的14.02%，平均D值为0.578；类群III为耐盐性较强的材料，包括27份材料，占总材料数的25.23%，平均D值为0.504；类群IV为耐盐性较弱的材料，包括21份材料，占总材料数的19.63%，平均D值为0.423；类群V为耐盐性弱的材料，包括28份材料，占总材料数的26.17%，平均D值为0.363；类群VI为耐盐性极弱的材料，包括6份材料，占总材料数的5.61%，平均D值为0.246(图2)。

图2 供试材料耐盐性聚类分析Fig.2 Cluster analysis of salt resistance of tested materials

2.6 灰色关联度

使用公式(5)(6)(7)对14个指标进行灰色关联度分析，以D值作为参考序列，14个指标的抗性指数作为比较序列进行分析。各指标抗性指数与D值关联度(表5)排列顺序如下：全叶面积>幅长>脯氨酸>幅宽>干重>茎粗>Fv/Fo>鲜重>丙二醛>株高>Fo/Fm>可溶性糖>SPAD>Fv/Fm。

表5 各抗性指数的灰色关联度及排序Table 5 Grey correlation analysis and rank of resistance index

3 讨论

研究表明，苜蓿苗期对盐胁迫比较敏感，易遭受盐害影响导致发育迟缓甚至死亡，而生长的后期对盐胁迫表现的就相对不敏感，苗期是评价黄花苜蓿耐盐性的最佳时期[14-16]。因此,本试验使用苗期黄花苜蓿进行盐胁迫处理，筛选耐盐材料。

3.1 耐盐指标的筛选

植物的耐盐性评价因涉及到渗透胁迫、离子胁迫和pH胁迫等众多因素的影响，是一个十分复杂的机制[17]，所以通过从形态、生理、光合等多个方面进行分析评价才能真实反映植物耐盐性的大小。在盐胁迫下，植物的生长速率，生物量等直接指标均被抑制，株高及生物量显著下降[18]。盐胁迫下，植物细胞膜受损，产生过氧化产物，丙二醛作为过氧化产物随着盐浓度的上升而上升[19-21]。植物遭受盐胁迫时，通过降解大分子以降低渗透势，以保证逆境条件下水分的正常供应[22]，随着盐浓度的上升，植物体内可溶性糖的含量也在上升[23]。脯氨酸作为植物逆境胁迫下的渗透调节物质与抗逆性紧密相关[24-25]，植物在盐胁迫时脯氨酸不断累积，提高细胞对水分的保持能力，增强植物对盐胁迫的适应性[26]；但也有研究表明，随着盐胁迫浓度的增加，脯氨酸的积累呈先升高后下降的趋势[18,27]。一般认为，植物受到盐胁迫时，叶面积降低，光合作用也会受到抑制，随着盐浓度的上升，生长速度降低，总叶面积降低；叶绿素酶活性提高，叶绿素含量减少，导致植物光合能力下降[13,27-29]。

本试验中，107份材料在盐胁迫下各项形态指标与光合指标均不同程度下降，生理指标不同程度上升，与前人研究一致。通过主成分分析确定鲜重、干重、幅长、全叶面积、幅宽、Fo/Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、脯氨酸、可溶性糖、SPAD为主要作用因子。并通过计算各指标抗性指数与耐盐性度量值的灰色关联分析，筛选出全叶面积、幅长和脯氨酸可作为鉴定耐盐性的关键指标。

3.2 耐盐性评测方法

因苜蓿的耐盐性是一个复杂的特性，与多个指标相关，故一般进行苜蓿耐盐性鉴定多采用综合评价：李源等[16]运用聚类分析、标准差系数赋予权重法18个国外苜蓿品种的苗期耐盐性进行了综合评价；梁晓等[30]对10个紫花苜蓿品种的萌发期和生长期的耐盐性进行了分析，以7个性状指标均值为依据，通过综合指标法和灰色关联度法，确定了耐盐与敏盐品种；李明雨等[31]研究了不同盐浓度下22份苜蓿萌发期的耐盐性，筛选出耐盐材料及敏盐材料，并确定1.2% NaCl为苜蓿萌发期耐盐性鉴定的最适浓度；杨紫贻等[32]对30份紫花苜蓿材料及耐盐性分析，通过隶属函数及综合分析，将其耐盐性分为3类，并确定“中苜1号”苜蓿耐盐性最强，“陇东”苜蓿耐盐性最弱；张则宇等[13]以13个指标的耐盐系数为基础，运用加权隶属函数法、灰色关联法、聚类分析将59份苜蓿划分为5个耐盐性不同类群，并确定了4个苜蓿苗期耐盐鉴定指标。鱼小军等[33]比较了扁蓿豆(MelissilusruthenicusL.)和苜蓿萌发期的耐盐性强弱，通过对5项指标进行隶属函数综合分析，认为苜蓿的耐盐性强于扁蓿豆；金艳等[34]以14个苜蓿杂交组合F1代为试验材料，使用隶属函数法选出耐盐性较好的杂交组合。

本试验中，通过测定14个指标的抗性指数，采用加权隶属函数法对107份供试材料耐盐性进行综合评价，并通过聚类分析将其划分为6个耐盐类型。

4 结论

通过对14个指标进行主成分分析、隶属函数分析及灰色关联度分析得出全叶面积、幅长和脯氨酸等3个指标可作为黄花苜蓿苗期耐盐性评价的关键指标；107份材料耐盐能力分为6类，耐盐能力较强的3份材料为84，48，97；耐盐能力较差的3份材料依次为21，57，59；本试验研究结果可为苜蓿耐盐性评价及耐盐性育种提供理论和材料基础。