60Co-γ射线对青绿苔草种子萌发及幼苗生长的影响

王 萌, 张康成, 范希峰, 滕文军, 温海峰, 张 辉, 高 康, 滕 珂, 武菊英, 岳跃森*

(1.北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所， 农业农村部华北都市农业重点实验室， 北京 100097； 2.北京农学院植物科学技术学院， 北京 102206)

苔草属(CarexL.)是莎草科(Cyperaceae)多年生草本植物，其种类繁多，全球约2 000种以上，广泛分布于世界各地，是莎草科中的最大属之一，仅次于大戟属和胡椒属。中国苔草属植物达500 种以上，在我国分布范围较广，内蒙古、黑龙江、吉林、河南、山东、陕西、江苏、四川、浙江、台湾等地均有分布[1-3]。

苔草属植物不仅具有春季返青早、根茎发达、绿期长、形态优美的特点，而且均有耐旱和维护成本低等优点，既可以作为优良的林下或建筑物背荫处地被植物，也可以作为观赏草与其他植物配置应用[3]。在北方地区的园林绿化中作为地被应用的苔草主要有涝峪苔草(Carexgiraldiana)、青绿苔草(Carexbreviculmis)等[4]。当前对于青绿苔草的研究主要侧重于应用方向。杨学军等[5]发现低浓度的赤霉素处理和浓硫酸处理30 s均可以有效提高青绿苔草种子发芽率；温海峰等[6]研究青绿苔草混播技术，发现青绿苔草和冷季型草坪草混播后，播种量是5 g·m-2时其株高较高，且同样播种量和多年生黑麦草(LoliumperenneL.)混播后青绿苔草自身根长优势明显；以及在光合特性[7]、抗旱性[8]、蒸散特性[9]、抗寒性[10]等植物生理方面也有相关研究。然而，有关青绿苔草育种方面的研究鲜有报道。

诱变育种是一种在不改变优良品种遗传背景情况下，改善品种性状的有效策略[11]。在19世纪末，放射性物质的发现对于诱变育种研究进程具有极大地促进作用，果蝇辐射试验以及20世纪40年代开始的化学诱变剂的使用，是如今诱变育种常用的两种方法[12]。其中，物理诱变包括电离状态下的辐射和非电离状态下的辐射两种形式。电离状态下的辐射如X、γ、β射线以及由夸克组成的中子等，非电离辐射如激光照射和紫外线辐照等方式[13]。1928年Stadler[14]首次将X射线应用到玉米和小麦上，成功诱导了小麦产生了突变体，开启了辐射诱变的新育种领域。我国植物辐射诱变育种工作起步较晚，主要研究γ射线和中子。其中60Co-γ射线穿透力强，变异谱大，诱导的变异性状可在当代进行筛选，目前作为一种便捷的育种方法被广泛应用于多种植物中[15]，在花卉[15-16]、果树[17]以及农作物[18-19]等方面都取得了一系列的成果。孙音等[15]对兜兰组培苗进行了60Co-γ射线辐射，得到了变异性状明显且效果稳定的植株；胡钟东等[20]用辐射诱变清香梨的休眠枝，获得了大果型突变株系；刘建凤等[19]对小麦扬辐麦4号经过辐射诱变，得到了优良的突变体新种质资源，为培育小麦新品种奠定了基础。

目前，尚无辐射诱变技术在青绿苔草育种中应用的报道。本研究采用不同辐射剂量的60Co-γ射线对青绿苔草种子进行诱变处理，通过研究不同辐射剂量对青绿苔草种子萌发及幼苗生长的影响，探讨青绿苔草种子适宜60Co-γ射线辐射剂量，为今后利用60Co-γ射线辐射诱变技术提高青绿苔草遗传多样性、创造新种质、培育优良新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的青绿苔草种子来自北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所，于2021年4月份采收，试验前将种子通风干燥处理后放入自封袋中并冷藏保存。

1.2 试验方法

1.2.1种子辐射 处理将青绿苔草的干种子包装于自封袋中，在中国计量科学研究院辐射中心进行60Co-γ射线辐射处理。查阅整理相关文献后准备进行7个梯度的辐射处理，辐射剂量分别为0(对照)，75，100，150，250，450和650 Gy，辐射剂量率为1 Gy·min-1。每个处理3次重复。

1.2.2种子消毒 选取适量青绿苔草种子，先使用5%次氯酸钠溶液消毒20 min后，用蒸馏水清洗青绿苔草种子3～5遍，再加入蒸馏水于离心管中浸种24 h后进行发芽试验。

1.2.3种子发芽试验 在每一个培养皿内铺设3张滤纸，用蒸馏水浸透，整齐放入50粒处理好的青绿苔草种子，每个辐射处理重复3次。将所有培养皿放入到人工气候培养箱(10 h黑暗/14 h光照，25℃/23℃)中。从第2日开始每日记录种子的发芽情况，并且及时给种子补充蒸馏水，防止种子缺水，总共观察记录18天，以青绿苔草种子胚根突破其种皮且长度与种子等长为萌发标准。

1.2.4成苗率试验 将消毒处理后的青绿苔草种子均匀播种到穴盘中，穴盘中每穴1粒种子，每一个处理播种50粒，进行3次重复试验，置于温室培养。青绿苔草种子在7 d后开始记录出苗情况，总共观察记录25天后进行成苗率测定。

1.2.5种子生长 指标的测定发芽试验进行18天，每日记录发芽数据，计算种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数(计算公式如下)，随机选择5株长势良好的青绿苔草幼苗，分别测量其根长、苗高和鲜重。取每个指标的平均值进行方差分析。

种子活力指数VI=S×GI

公式中：Gt表示在第t天种子的发芽数，Dm表示对应青绿苔草种子发芽所处的天数，总共18天发芽数据。S表示种苗生长势情况(鲜重或者长度大小)。

1.2.6半致死剂量 为了确定适宜辐射剂量，根据周小梅等[21]的方法计算出青绿苔草种子的半致死剂量。根据青绿苔草种子不同辐射剂量下的相对出苗率建立y=a+bx的拟合线性回归方程，辐射剂量和青绿苔草种子的相对成苗率值分别作为自变量和因变量，研究采用青绿苔草种子的成苗率为50%时来确定其半致死剂量。

1.3 数据处理与统计

采用Excel进行数据的处理和图表的制作。使用SPSS 18.0进行单因素方差检验分析，LSD法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ辐射剂量对青绿苔草种子萌发的影响

表1可知，不同60Co-γ辐射剂量对青绿苔草种子萌发产生不同的影响。未经辐射处理的对照种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数最高，分别为89.3%，56.0%，43.7% 和82.6%，随着60Co-γ辐射剂量的增加，青绿苔草种子发芽相关各项指标均逐渐降低，辐射处理对青绿苔草的种子萌发表现出抑制作用。在发芽率中，除75 Gy和100 Gy发芽率和0 Gy相比差异不显著外，其辐射处理都与对照相比差异显著(P<0.05)。其中，辐射剂量为450 Gy至650 Gy时，发芽率下降最明显，与对照相比减少了48.5%，青绿苔草种子发芽受到强烈的抑制作用。在发芽势随辐射剂量增加而逐渐减小的过程中，各辐射剂量处理后的发芽势都和对照组有显著差异(P<0.05)，且0至75 Gy时，发芽势的下降最为明显。从发芽指数和活力指数下降过程中，每一个梯度处理后数值均与对照组差异显著。此外，在辐射剂量为450 Gy和650 Gy时，活力指数为0，青绿苔草种子已经丧失活力，抑制作用最明显。

表1 不同60Co-γ射线辐射剂量对青绿苔草种子萌发的影响Table 1 Effects of different radiation doses of 60Co-γ on seed germination of Carex leucochlora

2.2 不同60Co-γ辐射剂量对青绿苔草成苗率的影响

表2可知，不同60Co-γ辐射剂量处理对青绿苔草成苗率的影响差别明显，随着辐射剂量的增加，青绿苔草种子的成苗率显著下降。其中，辐射剂量为75 Gy，青绿苔草成苗率最高；辐射剂量为75 Gy至100 Gy时，成苗率下降最明显，与对照相比减少了61.3%。当辐照强度为450 Gy和650 Gy时，其达到或超过其致死剂量的限度，青绿苔草成苗率为0。图1表明，辐射对青绿苔草成苗率的影响与辐射剂量呈负相关(R2=0.6601)。

表2 60Co-γ射线不同辐射剂量处理对青绿苔草种子成苗率和幼苗生长的影响Table 2 Effects of different radiation doses of 60Co-γ on seedling rate and growth of Carex leucochlora

图1 不同辐射剂量处理下青绿苔草实际成苗率Fig.1 Seedling rate of Carex leucochlora under different radiation doses

2.3 不同60Co-γ辐射剂量对青绿苔草幼苗生长的影响

表2可知，青绿苔草幼苗的根长、苗高和鲜重值均随着60Co-γ辐射剂量增加而逐渐减少，显示出60Co-γ辐射抑制青绿苔草幼苗生长。未经辐射处理，青绿苔草幼苗的根长、苗高和鲜重分别为2.66 cm、1.89 cm和4.1 mg，均处于最高。辐射处理(75 Gy至650 Gy)后，青绿苔草幼苗的根长和苗高鲜重均显著下降，然而鲜重下降差异不显著。当辐射剂量为250 Gy时，根长与苗高较对照减少幅度已经达到62.4%和63.0%，青绿苔草的生长已经严重受抑制。

2.4 青绿苔草种子半致死剂量的确定

研究采用相成苗率的数据计算出相对成苗率的拟合线性回归方程(图2)，从而确定出青绿苔草种子的半致死剂量。青绿苔草种子的相对出苗率与其辐射剂量呈现负相关，得出相对成苗率的拟合线性回归方程为y=80.832-0.2236x(R2=0.6708)，其中辐射剂量为自变量x，青绿苔草种子的相对出苗率为因变量y。本实验将50%时的种子相对出苗率作为确定半致死剂量的指标，代入到上述拟合线性回归方程中得到青绿苔草种子的理论半致死剂量约为138 Gy。

图2 不同辐射剂量处理下青绿苔草种子的相对成苗率Fig.2 Relative seedling rate of Carex leucochlora under different radiation doses

3 讨论

辐射所导致的种子萌发相关各指标包括种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等的下降可能与辐射造成的种胚组织受损，对细胞生长和分裂的抑制，以及萌发过程种子的生理活动影响有关[22]。萌发率的测定目前被认为是衡量不同种子诱变效果简便可靠的方法,随着辐射剂量的增加幼苗生长显著下降[23]。研究表明，烟草[24]、薏苡[25]和小麦[26]等植物种子被60Co-γ射线高剂量辐射后生长均会受到抑制。本研究采用不同辐射剂量(0，75，100，150，250，450和650 Gy)的60Co-γ射线对青绿苔草种子进行诱变处理，结果表明随着辐射剂量的增加，青绿苔草种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、成苗率等均逐渐降低，青绿苔草幼苗的苗高与根长的生长受到抑制逐渐明显，直至不能生长。本研究结果与上述结果一致。

然而，有研究发现低剂量的60CO-γ照射后对植物有一定促进作用[27-28]。王文恩等[29]对狗牙根(CynodondactylonL.)种子辐射效应的研究也发现相似现象，200至350 Gy低剂量的60CO-γ辐射对狗牙根幼苗的生长有一定的促进作用。这可能与辐射引起种子内部生物自由基或有关酶的活性变化有关，从而提高了种子的新陈代谢水平，促进了种子的萌发。但是，过高的辐射剂量能够种子胚受损，酶活性完全受到抑制或丧失，使细胞无法进行正常的分裂活动，从而影响了种子的正常萌发与生长。从本研究的结果中可以发现，辐射剂量为250 Gy时，青绿苔草的萌发率为68%，成苗率仅为3.3%；而辐射剂量为450 Gy时，青绿苔草种子的发芽率仍然有47.3%，但是其成苗率为零。这与周小梅等[21]对冷季型草坪草匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)、高羊茅(Festucaelata)、多年生黑麦草等辐射效应研究的结果一致。

通常低剂量辐射对种子损伤较小，其对非目标性状影响也相对较少,而高剂量辐射能引起较大范围的变异，但其对种子生理损伤加剧，种子成活率显著下降。因此，在采用辐射诱变方法进行种质创新和新品种培育的过程中选择适宜的辐射剂量是一个关键的因素。通常将植株成活率为50%时的辐射剂量即半致死剂量作为适宜的辐照剂量[30]。本研究通过种子相对成苗率的拟合线性回归方程计算得出青绿苔草种子的理论半致死剂量约为138 Gy，从而确定了青绿苔草种子适宜辐射剂量。余蓉培等[31]研究发现波士顿蕨(Nephralepisexaltata)的绿色球状体在不同辐射剂量的60Co-γ射线处理下，最适宜的辐射剂量为128 Gy。可见，不同的试验材料最终的半致死剂量是不同的。尹淑霞等[32]研究发现黑麦草(Loliumperenne)种子经60CO-γ射线照射处理后，试验中发芽率等所测指标同样显示出种子随辐射剂量增加，抑制作用变强，并且引起了酶指标的变化。赵静等[33]研究紫薇(Lagerstroemiaindica)种子的辐射效应，同样发现处理后辐射造成显著抑制性。这都与本次青绿苔草辐射试验结果基本一致，都是种子萌发和幼苗的生长指标与辐射的剂量大小呈现负相关。

本次研究诱变对于青绿苔草种子的影响还只是初步探讨，只是测定了发芽试验的常规指标，还可以对辐射后的材料进行染色体的鉴定、光合速率、蒸腾速率以及各项酶的指标的测定，以便于对辐射后的青绿苔草进一步的研究。

4 结论

青绿苔草种子在不同辐射剂量的60Co-γ射线处理下的萌发与生长存在较大差异，青绿苔草种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、成苗率等萌发相关指标和苗高、根长等生长指标均随着辐射剂量的增加而逐渐降低；根据种子的相对成苗率，初步确定青绿苔草种子的适宜辐射剂量(半致死剂量)约为138 Gy。本研究为今后利用60Co-γ射线辐射诱变技术提高青绿苔草遗传多样性、创造新种质、培育优良新品种提供了理论依据。