归芪粗提物乳酸菌液体发酵工艺研究

王坤丽，张梦洁

（河南牧业经济学院，河南 郑州 450046）

随着“饲料端禁抗、养殖端限抗、产品端无抗”的全面推进，畜牧业替抗产品的研发成为热点［1］，而发酵中药被视为一种理想的药物添加剂，具有安全性高、少副作用、低残留、低耐药性及功能广泛等优点，在畜禽养殖业有较强的发展潜力［2-3］。乳酸菌是一类可以在发酵过程中产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，在发酵中药领域是首选菌种［4-5］。黄芪、当归是经典名方当归补血汤的药物组成，其方补气养血、药少力专而应用广泛，中医方剂数据库统计显示，含有当归与黄芪药对的方剂有2 632首［6］。试验采用乳酸菌发酵归芪粗体物制备发酵中药，为畜牧业健康发展提供替抗产品和有效参考。

1 材料与仪器

1.1 主要材料

屎肠球菌和植物乳杆菌菌种由河南牧业经济学院发酵中药实验室提供；当归、黄芪2 种中药材购于河南顺康中药材有限公司，经检验符合药典标准；MRS培养基购自北京澳博星生物技术有限公司；无水乙醇购于山东禹王实业有限公司。

1.2 主要仪器

试验主要仪器设备见表1。

表1 仪器设备表

2 试验方法

2.1 菌种的活化

从-20 ℃冰箱取出冻存的屎肠球菌和植物乳杆菌半固体菌种，解冻后，分别接入已灭菌的MRS 液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。然后将两种菌分别以5%的接种量接种到已灭菌的MRS 液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，镜检。等量混合即得发酵所用的混合液体菌种。

2.2 归芪粗体物制备

按照2020版《中华人民共和国药典》［7］当归补血口服液处方，分别称取当归132 g 和黄芪330 g，第1 次10 倍水浸泡30 min 后煎煮1 h，第2 次8 倍水煎煮40 min，合并两次滤液，浓缩至231 ml即得归芪粗提取物。

2.3 归芪粗提物添加量的确定

该试验采用乳酸菌液体发酵，首先设归芪粗提物添加量分别为20%、30%、40%、50%、60%的试验组和不加归芪粗提物的MRS 培养基为对照组。调节各组培养基pH 为7，121 ℃温度下灭菌30 min，冷却后按5%接种量接种，37 ℃条件厌氧培养36 h，测定各组乳酸菌活菌含量及pH值，以确定最适宜添加量。

2.4 归芪粗提物发酵条件的确定

按最适宜添加量，采用单因素试验优化发酵工艺，依此考查接种量1%、2%、3%、4%、5%的接种量；25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃和42 ℃温度；发酵时间12 h、24 h、36 h、48 h、72 h，以活菌总数为主，以发酵液pH值为参考，确定发酵最佳条件；同时持续考察4 d、7 d、14 d的发酵液pH值和活菌总数以确定发酵状态。

2.5 发酵罐优化

采用优化后的发酵工艺，用5 L发酵罐进行发酵，并测定活菌总数和pH值，以验证工艺条件可行性。

2.6 乳酸菌活菌计数

采用活菌平板计数法进行，吸取1 ml样品匀液注入装有9 ml生理盐水的无菌试管中，震荡1～2 min，制成1∶10的样品匀液。吸取1 ml样品液于装有9 ml生理盐水的灭菌试管中，震荡混匀制成1∶100的稀释液，按上述操作依次倍比稀释至合适浓度。

选择2～3个合适稀释度，用无菌移液管分别吸取每个稀释度0.1 ml 到2 个MRS 琼脂平板上。用涂布棒快速涂匀后盖上平皿，稍放置后倒置于37 ℃±1 ℃培养箱中培养48 h±2 h。然后根据每毫升样品中菌落数=平板上菌落数×稀释倍数/平板中菌液添加量来计算发酵样品菌数。

3 结果及分析

3.1 归芪粗提物添加量的确定

试验结果见表2和图1。由表2和图1可以看出乳酸菌可以在归芪粗提物液体培养基中生长，并随着归芪粗提物添加量的增加，乳酸菌活菌数先升高后降低，当添加量为30%时，乳酸菌活菌数达到最高，达到22.72×108CFU/g。一定程度上可以说明，利用归芪粗提物培养乳酸菌，添加量要适宜，过低乳酸菌数较少，过大时会抑制菌落生长。归芪粗提物添加量对乳酸菌发酵液的pH值变化影响很大，pH 值在4.61～6.16 间变化，当粗提物添加量为30%时，pH值最低为3.95。结合乳酸菌数及pH 值变化情况，确定归芪粗提物添加量为30%。

表2 归芪粗提物添加量对乳酸菌的生长及发酵液pH值的影响

图1 归芪粗提物添加量对乳酸菌的生长及pH值影响

3.2 接种量对乳酸菌活菌总量的影响

试验结果如图2所示。可见接种量从1%～5%，发酵36 h时，发酵液中乳酸菌数量随着接种量增加先增加，到达峰值后维持数目基本不变，由结果可以看出，最佳接种量为3%。

图2 接种量对乳酸菌生长的影响

3.3 温度对乳酸菌活菌总量的影响

试验结果如图3 所示。可见温度对发酵影响较为显著，在37 ℃时发酵液中乳酸菌总数最大，而温度过高（42 ℃）或者过低（25 ℃、30 ℃）都会影响乳酸菌生长繁殖的性能，因此最佳培养温度为37 ℃。

图3 温度对乳酸菌生长的影响

3.4 发酵时间对发酵液pH及乳酸菌总量的影响

试验结果如图4 所示。可见乳酸菌总量随着发酵时间的推移逐步增加，在36 h达到最高峰，并维持高水平4 d左右，之后逐步下降。其变化与乳酸菌的增值有关，即乳酸菌在0～12 h 处于蓄势期或准备期增值缓慢，而在12 ～36 h 呈对数级快速繁殖，之后受环境pH 等影响处于逐步趋于水平增殖，在15 d后逐步凋亡活菌数降低。发酵制剂pH 值的变化也印证了乳酸菌活菌数的变化，即0～12 h 下降幅度较小，在12～36 h下降较快，36 h之后缓慢降低，直至15 d趋于恒定。根据活菌数和pH值变化，结合实际生产，确定发酵36 h达到高峰，7 d发酵完全。

图4 时间对乳酸菌生长的影响

3.5 发酵罐归芪粗提物乳酸菌发酵液pH及活菌数

试验结果如表3所示，采用发酵罐发酵同样在36 h时乳酸菌活菌总数最高，且基本持续至4 d，之后逐步降低；而发酵液pH 值则逐步降低，在3 d 后逐步降低至4.0 左右。证明此工艺条件可用作乳酸菌液体发酵归芪粗体物制备发酵中药。

4 讨论

益生菌发酵中药目前已成为中药领域的研究热点，而发酵条件如发酵培养基组分、菌种接种量、温度、时间等对发酵产物的成分组成、含量甚至活性有影响。发酵条件的优化能显著提高发酵效果，提高发酵产品的产出，接种量优化对于发酵影响较大，对发酵效果起着关键的作用。接种量过小，菌落生长繁殖非常慢，容易污染其他菌，同时影响发酵周期；而接种量过大时，菌落繁殖过快，营养迅速减少，容易造成发酵菌体老化，影响代谢产物的产生，影响发酵程度。越来越多的研究表明，中药多糖类成分尤其是补益类中药多糖成分对益生菌的生长有一定的促进作用［8］。该试验所用归芪粗体物主要成分为黄芪多糖和当归多糖，试验结果也显示，其屎肠球菌和植物乳杆菌发酵具有互作效果。同时对发酵条件优化后，可以制备出稳定的并具有较好活性的发酵中药制剂。发酵中药在现代畜牧业健康养殖、高效养殖上具有广阔的应用前景［9］。

5 结论

该试验通过单因素试验优化乳酸菌液体发酵归芪粗体物，并采用发酵罐进行验证，最终确定了最佳发酵条件为：归芪粗提物最适宜添加量为30%，接种量3%，发酵温度37 ℃，发酵时间36 h达最大活菌数，7 d及之后pH稳定不变。研究为替抗发酵中药研究提供了新思路，也为畜牧业健康养殖提供了更多可用饲料添加剂品种。