不同剂量彝药小红参乙酸乙酯提取物预防灌胃给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤的防治作用及其机制

肖湉，王礴，杨丽萍，段小花

云南中医药大学民族医药学院云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明 650500

缺血性心脏疾病严重危害人类生命健康，首要治疗原则是恢复血液灌注，但心肌在缺血后重新恢复血流灌注时反而容易出现血压骤降、心律失常等损伤加重的现象，称之为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）［1-2］。MIRI 严重影响缺血性心脏疾病的治疗进程，因此减轻MIRI是该病防治过程中需要解决的重要问题［3］。再灌注后产生大量活性氧引起的氧化应激是MIRI 发生的关键因素之一［4］。为了缓解这一损伤的发生，药理性预适应在治疗过程中启到至关重要的作用，近年越来越多药物靶点被发现，用来激活机体内源性保护MIRI 免受氧化应激的影响［5-6］。核因子E2 相关因子 2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）是抗氧化应激中的一个关键信号通路，对高氧化应激疾病具有一系列的保护作用［7-8］。传统医药在抗争MIRI方面具有显著优势，中医药虽没有治疗MIRI的相关明确记载，但根据其病位病症将该证归属于胸痹心悸之范畴，以活血化瘀、行气通络药为主，且如今已有多种单味药如丹参、人参、白芍等提取物用以防治MIRI［9］。小红参又名云南茜草，是茜草科茜草属植物滇南茜草Rubia yunnanensis（Franch.）Diels的干燥根及根茎，是云南民间常用的中草药［10］。小红参作为云南彝族、普米族常用的活血化瘀药，其根部水溶性部分可用于治疗心绞痛，且能增加小鼠心肌ATP 的含量、提高动物耐氧能力，和保护缺血缺氧心肌作用一致［11-12］。扆雪涛等［13］研究证明，小红参治疗垂体后叶素诱导的大鼠急性心肌缺血的重要活性成分主要存在于乙酸乙酯提取物，曹东等［14］报道，小红参乙酸乙酯提取物可抗小鼠常压耐缺氧，提示其具有较强的抗心肌缺血活性。但小红参乙酸乙酯提取物防治MIRI 的具体作用及其机制尚不明确。2021 年 10 月—2022 年 1 月，我们观察了彝药小红参乙酸乙酯提取物预防灌胃给药对大鼠MIRI 的防治作用，并探讨其作用机制，旨在为今后小红参防治心肌缺血性损伤及其进一步的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器 SPF 级健康SD雄性大鼠，体质量（280±20）g，购自昆明楚商科技有限公司，许可证号：SCXK（湘）2013-0004。每笼6 只饲养，每日光照约12 h，自由饮食、饮水，环境清洁、通风，温度（22 ± 2）℃，湿度40%～60%。动物饲养和实验均符合《医学实验动物管理实施细则》要求。彝药小红参Rubia yunnanensis（Franch.）Diels（由云南绿生药业有限公司提供并鉴定为正品）；复方丹参片（云南白药集团股份有限公司，国药准字：Z53021243）；依达拉奉（国药集团国瑞药业有限公司，国药准字：H20130051）；苏木素—伊红（HE）染液（上海瑞谷生物科技有限公司，批号：G1120）；Evans blue（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160228）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）测试盒、心肌肌钙蛋白I（cTnI）测试盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，序号：H197-1-2、H149-2、A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2）；Nrf2、SOD1、NQO1、HO-1、β-actin 基因序列（由昆明硕擎生物科技有限公司合成）。BL-420N 型生物信号采集处理系统（成都泰盟科技有限公司）；EOS60D 型Canon 相机（佳能（中国）有限公司）；心脏切片模具（上海玉研科学仪器有限公司）；Varioskan5250040 型全波长扫描式多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；NX-1R 冷冻型高速台式离心机（天津鼎昊源生物科技有限公司）；C1000型PCR 自动系列化分析仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 彝药小红参的制备 称取2 kg 药材打成粉末平均分成四份。将每份药材粉末分别加入4、3、2 L的95%乙醇浸泡30 min后，加热回流提取3次，合并提取液后抽滤，滤液减压回收乙醇，得到小红参浓缩液；将浓缩液用大型分液漏斗分离出乙酸乙酯部分后，减压回收得到小红参乙酸乙酯提取物，置于-80 ℃冰箱内冷冻保存。配制药液时，按照高、中、低浓度配制（低剂量为大鼠等效量给药浓度：0.005 67 g/mL；中剂量为大鼠3 倍等效量给药浓度：0.017 g/mL；高剂量为大鼠5 倍等效量给药浓度：0.028 g/mL），每次灌胃时提前半小时加热药物。

1.3 实验动物分组、小红参乙酸乙酯提取物灌胃及心肌缺血再灌注操作 选同一批次心电图检测合格的大鼠60 只，随机分为小红参高剂量组、小红参中剂量组、小红参低剂量组、MIRI 组、复方丹参组（阳性对照组）、假手术组（阴性对照组）各10 只。小红参高剂量组、小红参中剂量组、小红参低剂量组制模前分别灌胃给予 0.028、0.017、0.005 67 g/mL 的小红参乙酸乙酯提取物，每日一次，饲养灌胃7 d 后进行大鼠心肌缺血30 min/再灌注120 min 损伤操作，即通过冠状动脉左前降支下部结扎法联合气管插管；复方丹参组制模前灌胃给予复方丹参片水磨液1 mL/（100 g·d），饲养灌胃 7 d 后进行 MIRI 操作；MIRI 组灌胃给予同体积 1 mL/（100 g·d）蒸馏水，饲养灌胃7 d 后进行MIRI 操作；假手术组灌胃给予同体积1 mL/（100 g·d）蒸馏水，饲养灌胃7 d后不进行MIRI操作，仅穿线但不结扎。通过监测大鼠心电图变化及双染法染色观察心肌梗死面积，筛除MIRI操作未成功或已死亡的大鼠［15］。

1.4 大鼠心电图监测 除假手术组外，各组大鼠于结扎前10 min、结扎后30 min、剪线再灌注120 min后3个时间点观察大鼠心电图并截图记录。

1.5 大鼠心肌病理组织学观察 采用苏木素-伊红（HE）染色。再灌注120 min 后，迅速剪取大鼠心脏，4 ℃、0.9%生理盐水冲洗干净，切取结扎位置至心尖部分的心肌组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，24 h 后制作石蜡切片使用HE 染色，显微镜下观察大鼠心肌组织形态。

1.6 大鼠心肌梗死面积 再灌注120 min 后，进行复位结扎，使心肌再次处于缺血状态，随后剖开大鼠腹腔下部，经下腔静脉注射1%Evans blue 2 mL，观察心脏非缺血区充分蓝染后，与此同时可见口唇爪面全身变蓝时，取出心脏，置于4 ℃生理盐水中，反复冲洗干净，后用滤纸吸干心脏上附着的生理盐水，置于小托盘中并在-80 ℃冰箱冰冻2 min 左右，使其足够硬以后期便切取，从心尖至心底方向纵切成厚度为2 mm 左右的薄片。将切好的心脏切片放入盛有1%TTC 磷酸盐缓冲液的棕色溶剂瓶中，置于37 ℃恒温水浴锅，振荡浸泡15 min 后取出，用滤纸吸去残液冷，10%甲醛固定，24 h后取出切片并用滤纸吸干平铺于白色打印纸上，数码相机拍照，用Image-Pro-Plus6.0 和Photo shop 图像分析软件处理图片，分析各组大鼠的心肌缺血面积、梗死面积。心肌颜色分布中，蓝色为正常心肌组织，代表非缺血区；白色为梗死心肌组织，代表梗死区（IS）；红色为缺血心肌组织，红色区域（含白色区）代表缺血区（AAR）。梗死范围计算公式：IS（%）=IS/AAR×100%。

1.7 大鼠血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测 再灌注120 min 后，大鼠腹主动脉采血5 mL，静置30 min后，置于离心机中（4 ℃，3 000 r/ min）离心15 min，吸取上清液并分装。严格按照相关试剂盒说明书测定大鼠血清中 cTnI、CK-MB、GSH-PX、SOD 和 MDA含量。

1.8 大鼠心肌组织Nrf2、超氧化物歧化酶1（SOD1）、血红素氧合酶1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）mRNA检测 采用RT-PCR法。取大鼠心肌组织提取总RNA 后逆转录为cDNA。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环。以 βactin 为内参，采用 2-ΔΔCt法测定各组大鼠基因相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，完全随机设计两组间比较使用完全随机设计T检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心电图比较 假手术组大鼠心电图显示其心脏电活动全程保持正常状态。MIRI 组结扎30 min后，大鼠局部心肌组织苍白或发绀，二导联图显示ST段弓背上抬0.2 mv以上，QRS宽大畸形，T波高耸，出现心律失常；再灌注120 min 后大鼠心尖复红，ST 段回落50%以上。复方丹参组与小红参高、中、低剂量组结扎30 min 后，大鼠局部心肌组织苍白或发绀，二导联图显示ST 段弓背上抬，QRS 宽大畸形，T波高耸，出现心律失常但ST段抬高程度均低于MIRI 组；再灌注120 min 后大鼠心尖复红，ST段回落50%以上，各药物组ST 段回落明显，ST 段几乎回落到正常范围，小红参高剂量组更为明显。

2.2 各组大鼠心肌病理组织学比较 各组大鼠心肌病理组织学比较详见图1。假手术组心肌纤维大小结构均显示正常，肌丝排列整齐，细胞核、细胞质界线清楚，染色均匀，未见坏死、出血等表现。MIRI组心肌纤维肿胀紊乱，部分出现断裂细胞核与细胞质界线模糊，心肌细胞局灶性坏死，间质炎细胞浸润损坏肌纤维内部，水肿明显。小红参高、中、低剂量组与复方丹参组可见心肌细胞轻度肿胀，散见少数坏死和间质出血，与MIRI 组比较，间质炎细胞浸润明显减少，其中高剂量组改善效果更为明显。

图1 各组大鼠心肌病理组织学比较（HE，×400）

2.3 各组大鼠心肌梗死面积比较 小红参高剂量组、小红参中剂量组、小红参低剂量组、复方丹参组、MIRI 组、假手术组心肌梗死范围IS 数值分别为（12.86 ± 2.94）% 、（15.09 ± 4.87）% 、（15.36 ±5.38）%、（17.05 ± 5.14）%、（56.31 ± 9.71）%、0%，假手术组、四种药物组与MIRI 组比较，以及小红参高剂量组与低剂量组相比较，P均＜0.05。

2.4 各组大鼠血清 cTnI、CK-MB、MDA、GSH-Px、SOD 活性比较 大鼠血清cTnI、CK-MB、MDA、GSHPx、SOD活性比较见表1。

表1 各组大鼠血清cTnI、CK-MB、MDA、GSH-Px、SOD活性比较（）

表1 各组大鼠血清cTnI、CK-MB、MDA、GSH-Px、SOD活性比较（）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与MIRI组比较，*P＜0.05；与复方丹参组比较，△P＜0.05；与小红参低剂量组比较，▲P＜0.05；与小红参中剂量组比较，▽P＜0.05。

MDA（mmol/mgprot）1.29±0.33*1.76±0.51*2.31±0.41*2.06±0.22*4.18 ± 1.57#△▲▽1.25±0.23*组别小红参高剂量组小红参中剂量组小红参低剂量组复方丹参组MIRI组假手术组cTn I（μg/L）758.8 ± 80.5*△▲▽910.6±112.1*988.7± 93.8#939.2±148.0 1 070.0 ± 72.5#▽818.8 ± 80.5*▲CK-MB（U/L）60.11 ± 8.36*△▲71.55± 4.07*76.22± 7.46#*83.66± 8.63#*158.20 ± 18.13#△▲▽60.36 ± 9.01*△▲GSH-Px（U/mL）2.85 ± 3.72*△▲2.41±3.34#*2.39±3.22#*2.17±3.00#*1.45 ± 3.49#△▲▽3.05 ± 2.38*△▲▽SOD（U/mgprot）24.67±2.73#*▲22.29±0.83#*21.81±0.68#*22.74±0.84#*18.95 ± 1.56#△▲▽28.28 ± 3.82*△▲▽

2.5 各 组 大 鼠 心 肌 组 织 Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 mRNA 相对表达量比较 大鼠心肌组织Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 mRNA 相对表达量比较见表2。

表2 各组大鼠心肌组织Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 mRNA相对表达量比较（）

表2 各组大鼠心肌组织Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 mRNA相对表达量比较（）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与MIRI组比较，*P＜0.05；与复方丹参组比较，△P＜0.05；与小红参低剂量组比较，▲P＜0.05；与小红参中剂量组比较，▽P＜0.05。

NQO1 mRNA 8.57 ± 1.11#*△▲6.98±0.78#*▲4.83±0.32#▽6.13±0.64#*4.43 ± 0.57#△▽2.80 ± 0.44*△▲▽组别小红参高剂量组小红参中剂量组小红参低剂量组复方丹参组MIRI组假手术组Nrf2 mRNA 5.51 ± 0.98#*△▲4.28±0.90#*3.71±0.74#*3.27±0.65#1.93± 0.51▲▽1.19± 0.23△▲▽SOD1 mRNA 4.77±0.89#*3.56±0.53#2.10±0.56#2.12±0.20#1.72±0.19 1.17± 0.26△▲▽HO-1 mRNA 3.49±0.62#*2.72±0.79#2.21±0.30 2.47±1.08 1.72±0.50 1.62±0.32▽

3 讨论

MIRI 发生时重新恢复的血流灌注，反而容易出现损伤加重的现象，表现为血压骤减、心功能不全、心律失常，甚至猝死的症状［16］。由于MIRI病理生理过程的复杂性，临床上将MIRI 治疗分为四大方向：缺血预适应、药理性预适应、缺血后适应、药物后处理，在缺血预适应与缺血后适应研究中发现，机体具有较强的内源性保护作用［17］。因此，药理性预适应可激活相关保护通路进而改善MIRI带来的损伤，此方案安全性、可控性较高、操作更为简便，临床应用范围较广［18］。为了预防和缓解MIRI，改善心肌损伤程度及长期预后，因此对于心肌缺血的预处理研究具有重大意义［19］。MIRI 因其胸部闷痛，心痛彻背，背痛彻心，心悸不得安等临床表现，中医将其归属于“胸痹、心痛、心悸、真心痛、怔忡”的范畴。中医活血法可疏通周身微血管，有效代谢病理产物，保护受损心肌［20］。

据《滇南本草》记载，小红参可“通行十二经络”，其性甘温，具有活血通经、调养气血等功效［21］。昆明市延安医院使用小红参制作的酒浸剂与糖浆剂可治疗神经衰弱引起的失眠症状，且相关针剂对治疗心脏疾病亦有一定疗效［22］。课题组前期研究发现，小红参醇提物可通过改善线粒体功能、抗氧化等途径显著改善MIRI损伤，同时经过筛选发现其有效活性部位主要位于乙酸乙酯提取物中［23-24］。但小红参乙酸乙酯提取物在MIRI 中发挥作用及其具体机制尚不明确，因此本实验通过进行MIRI 操作，探讨小红参乙酸乙酯提取物预给药对MIRI损伤保护作用，挖掘其相关机制。

心电图代表心脏兴奋的电活动过程，可以反映心肌损伤的程度和发展。大鼠心电图ST 段抬高是观察心肌梗死的的重要途径，通过观察大鼠弓背抬高ST 段的回落情况可反映心肌组织血供的恢复情况，快速且幅度较大的ST段回落则显示冠状动脉再通和冠状动脉再灌注效果良好［25-26］。假手术组结扎前后无明显变化，提示假手术组穿线对心肌无明显损伤；MIRI 组和各药物组结扎后30 min 后ST 段上抬大于0.2 mv，且药物组上抬幅度小于MIRI 组，提示MIRI 组和各药物组MIRI 操作成功，小红参乙酸乙酯提取物预处理有提高心肌损伤耐受的作用；再灌注2 h 后，MIRI 组ST 段回落不如药物组明显。同时文献［27］报道，心肌组织形态变化可以直接反映心肌损伤的程度。本研究显示，假手术组肌丝排列整齐，无明显炎细胞浸润和水肿现象；MIRI 组心肌纤维肿胀紊乱，间质炎细胞浸润损坏肌纤维，且内部水肿明显；小红参乙酸乙酯提取物高、中、低三组剂量可见心肌细胞轻度肿胀，与MIRI 组比较，间质炎细胞浸润明显减少，提示小红参乙酸乙酯提取物可能对MIRI有保护作用；复方丹参组见少量间质炎细胞浸润损坏肌纤维内部，提示阳性药对受损心肌有保护作用。而心肌梗死面积作为判断MIRI 严重程度的诊断标准，心肌缺血区和梗死面积的大小是衡量MIRI 程度的最明显指标，能直观、客观地反映心肌梗死的程度［28］。TTC-伊文思蓝双染为判别心肌损伤程度的金标准，剪线再灌注2 h 后，假手术组缺血和梗死面积为0；MIRI组缺血和梗死面积明显，具有统计学差异，提示MIRI 会造成明显的心肌损伤，并说明MIRI操作成功。各药物组梗死面积显著减小，具有统计学差异，提示小红参乙酸乙酯提取物可以诱导心肌产生耐受，降低梗死面积，缓解心肌损伤程度。心肌酶学指标的变化反映心肌缺血的早期变化，当心肌细胞处于坏死状态时，线粒体、细胞膜遭到损伤，膜通透性异常增加，此时便会引起细胞膜破坏以及心肌标志物外漏［29］。CK-MB 为心肌坏死的重要标志物，当心肌细胞受到损伤时血清中CK-MB含量会显著升高，为诊断心肌坏死的金标准；cTnI是心肌细胞特有的一种蛋白质，对于反映心肌细胞损害程度具有较高的敏感性和特异性，均可反映心肌坏死程度［30-31］。本研究发现，药物组预处理后CKMB、cTnI 水平均低于MIRI 组，其中小红参高剂量组与中、低剂量组差异具有统计学意义。综上结果可知，小红参乙酸乙酯提取物对心肌具有明显的保护作用，尤其以高剂量组改善效果最为显著。

同时血清中的GSH-Px 和SOD 可间接代表抗氧自由基的能力，心肌组织中MDA 的活性是心肌脂质过氧化损伤的直接指标。本研究发现，药物组预处理后 MDA 水平均低于 MIRI 组，GSH-Px 和 SOD 活性明显改善，说明小红参乙酸乙酯提取物可以通过减轻氧化应激反应从而降低心肌缺血再灌注心肌损伤程度，达到治疗效果。在MIRI 过程中，如果过量的氧化产物超过了机体的清除能力，就会导致心肌细胞死亡。因此，寻找能够激活抗氧化途径的药物治疗MIRI 起到至关重要的作用。Nrf2/ARE 是抗氧化剂系统中的关键信号通路［32］。当细胞受到氧自由基或其他亲核试剂的刺激时，Keap1 释放Nrf2，然后Nrf2 进入细胞核，识别ARE 并开始表达下游基因NQO1、SOD 和 HO-1。HO-1 和 NQO1 是 Nrf2 开始表达后的两个关键靶蛋白，而SOD1 是超氧化物歧化酶中的一种，是好氧生物超氧阴离子歧化的主要酶。若SOD1 活性降低，则SOD-1 的抗氧化作用减弱，氧自由基浓度增加，导致氧化应激损伤［33-34］。本文结果表明，MIRI 组中MIRI 大鼠相关mRNA 表达虽有轻微增加以对抗氧化应激带来的心肌损伤，但与假手术组相比差异无统计学意义；而小红参乙酸乙酯提取物各药物组和复方丹参组相关mRNA表达较假手术组组均有明显提高，其中高剂量组Nrf2、NQO1 mRNA 表达较中低剂量上升最为显著，差异具有统计学意义。因此，小红参乙酸乙酯提取物保护MIRI的药理机制很可能与激活Nrf2/ARE 信号通路进而减轻氧化应激损伤有关。

总之，不同剂量小红参乙酸乙酯提取物预防灌胃给药均对大鼠心肌缺血再灌注损伤有防治作用，尤以0.028 g/mL 效果最佳，机制可能与其激活氧化信号通路Nrf2/ARE有关。