组织新型快速脱水试剂对病理制片效果的影响

施晓柯，林毅妍，何萍，万根平，岳永亮

(1.广州医科大学附属第一医院病理科，广东 广州 510120;2.百年永康医疗器械(广州)有限公司，广东 广州 510700)

病理诊断需要制片优良、染色对比清晰的玻片作为前提，而组织充分固定、脱水是制作一张优良病理玻片的基石[1]。目前，病理组织标本经过固定、脱水和浸蜡等程序常规处理大概要12～16 h[2]，病理报告发出时间需2～3 d，对于需要分子检测和免疫组化辅助诊断的病例需要的周期可长达4～5 d。因此，探讨如何缩短病理组织处理时长，对于提高病理报告发出及时性具有重要意义[3]。本研究通过比较组织新型快速脱水试剂与常规组织脱水试剂在临床病理标本HE制片、免疫组化、特殊染色和FISH等方面的差异，探讨组织新型快速脱水试剂在临床病理组织脱水处理系统中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 组织标本

随机收集2021年2月至2022年1月广州医科大学附属第一医院病理科送检新鲜冰冻组织标本共40例，其中肺组织35例、甲状腺3例、子宫2例。对照组取材大小为2 cm × 1.5 cm × 0.2/0.3 cm[4]，行常规脱水处理。实验组根据新型组织快速脱水试剂使用说明要求进行取材，取材组织大小为1 cm × 0.1 cm × 0.1 cm。

1.2 试剂和仪器

苏木素-伊红试剂购买自DAKO试剂公司；无水乙醇、二甲苯和石蜡购买自广东汕头西陇化工有限公司，免疫组化使用的抗体来自Roche、Leica和DAKO试剂公司，二抗试剂、柠檬酸抗原修复液及DAB显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司；对照组使用脱水机为Tissue-Tek VIP6组织脱水机(SAKURA)，实验组组织新型脱水试剂由BNKPATH公司提供，由于标本量少，故进行手工操作；切片机为Thermo的流水切片系统；HE染色使用DAKO的全自动染色一体机；免疫组化使用Roche、Leica及DAKO公司的全自动免疫组化染色机；FISH使用ThermoBrite 原位杂交仪。

1.3 组织处理方法

对照组：使用Tissue-Tek VIP6组织脱水机行常规脱水浸蜡。

实验组：使用新型快速组织脱水试剂手动处理，新型快速组织脱水试剂一套包括两瓶试剂，试剂A和试剂B，试剂A主要用于组织的快速固定，试剂B主要用于组织的快速脱水，两组标本经包埋完成后常规切片3 μm，进行染色，具体处理方法见表1。

表1 两组标本脱水处理程序一览表(min)

1.4 检测方法

两组均应用DAKO封闭式一体机进行HE染色封片；IHC为本科室使用的Roche、Leica及DAKO的全自动免疫组化染色机进行检测；特殊染色为本科室手工操作，操作步骤按照《临床技术操作规范·病理学分册》[4]进行；FISH检测严格按照试剂公司提供的操作步骤进行。

1.5 结果判定

均由两位高年资以上医生进行镜下阅片评分。

1.5.1HE和特殊染色染色评判标准 HE染色效果以《临床技术操作规范·病理学分册》[5]为标准进行评判：(1)着色强度评分：深染3分、中等染色2分、浅染1分。(2)胞核胞浆及胞膜着色对比度评分：清晰3分，部分清晰2分，不清晰1分；(3)组织切片完整性评分：完整为3分，部分完整为2分，不完整为1分；(4)细胞结构完整评分：完整为3分，部分完整为2分，不完整为1分；四项得分相加为HE染色效果评分总分，满分为12分[6]。特殊染色结果判读标准参考《临床病理学技术操作指南》HE判读标准中的“染色清晰，对比度好，定位准确”，总分为10分。

1.5.2免疫组化评判标准 免疫组化结果判读标准如下：(1)按阳性细胞比例判读：>50%为3分，10%～50%为2分，<10%为1分，无阳性细胞为0分；(2)按阳性信号强度判读：棕黄色为2分，淡黄色为1分，无着色为0分；(3)按阳性信号定位准确性判断：>90%阳性信号定位准确为3分，50%～89%定位准确为2分，<50%定位准确为1分，满分为9分[7]。

1.6 统计学分析

应用SPSS 17.0统计学软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脱水时长比较

对照组平均脱水时长为(781.9±15.32)min；实验组平均脱水时长为(108.03±6.30)min，实验组脱水时长低于对照组(t=257.300，P<0.001)。

2.2 HE染色质量比较

实验组有2例样本，因为取材体积大于组织新型快速脱水试剂的说明书要求而造成组织脱水不充分，影响制片效果，其余38例样本均切片完整，无皱褶，无刀痕，胞浆胞核染色对比清晰，见图1。对照组HE染色总评分为(10.73±1.06)分，实验组HE染色总评分为(10.53±1.08)分，两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且实验组的4个项目单独评分与对照组相比，均P>0.05，说明组织经新型脱水试剂处理后具有和常规处理一样的染色效果，见表2。

表2 对照组与实验组样本HE染色评分比较

注：A：对照组；B：实验组

2.3 IHC染色比较

两组样本均进行TTF-1、CK7、P63等抗原检测，如图2显示，实验组和对照组免疫组化结果均具有良好一致性，抗原显示定位清晰准确，阳性信号染色强度均为强度至中等。两组免疫组化评分结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 对照组与实验组样本IHC染色评分比较

注：A～C分别为对照组TTF-1、CK7和P6染色；D～F分别为实验组TTF-1、CK7和P63染色

2.4 特殊染色比较

两组均进行六胺银染色、PAS染色和弹性纤维染色，其中实验组弹性纤维染色和网状纤维染色，组织结构清晰，染色对比鲜明，即使纤细的纤维组织也能清晰显示出来，两组特殊染色结果无明显差异，见图3。

注：A～C分别为对照组六胺银染色、PAS染色和弹力纤维染色；D～F分别为实验组六胺银染色、PAS染色和弹力纤维染色

2.5 对照组和实验组FISH检测的比较

两组标本均进行MAML2、MDM2和SYT等基因FISH检测，实验组检测结果和对照组一致，但实验组基因的清晰度低于对照组，可能和样本处理时间有关，具体原因待进一步探讨。MAML2基因的FISH检测结果代表图见图4。

注：A：对照组；B：实验组

3 讨 论

病理标本从固定到制片过程中，前期标本的固定脱水占据了较长的时间，大约15 h[8]。为加快病理报告发放的时效，许多医院推出了快速石蜡这一概念，即穿刺小标本、胃肠镜标本及支纤镜标本等。由于组织较小，需要固定脱水的时间也较短，医院将这部分标本集中起来处理，进行快速固定脱水处理，从而实现早出片、早发报告[9]。快蜡的出现有利于临床医生早诊断、早治疗，提高临床病床周转率。目前，大部分医院的快蜡处理都是在脱水机仪器上通过缩短组织在各个试剂中的处理时长或者通过微波加热、超声处理等方法加快试剂浸入组织内部来实现的[9-11]，但仍然需要6～8 h，而且很多医院限于快蜡标本较少，标本送检不集中不定时，需要等各个临床科室的快蜡标本配送至病理科后统一进行上机处理，单个样本快速送检不具有及时性，且快蜡标本固定、脱水、浸蜡最快要6 h左右，组织脱水完成后进行后续的包埋、切片、HE染色，总共时长8 h左右。对于快蜡标本比较少的医院，上机处理需要耗费更高的试剂成本和人工成本。也有医院会将快蜡标本随常规样本一起上机进行过夜固定脱水处理，在第二天对快蜡标本进行先包埋、先切片，保障快蜡样本是第二天最早出片、最早阅片。因此，市场上亟待需要一种可以进行快蜡处理的新型试剂，既能保证染色效果质量稳定，还要满足医院不同数量快蜡标本的批次处理。

本研究对百年永康公司提供的组织新型快速脱水试剂进行实验比较，探讨其与临床病理科常规使用的固定脱水试剂对病理标本的脱水及染色效果的不同。组织新型快速脱水试剂分为试剂A和试剂B，为无色至浅黄色透明液体，主要成分为固定液、脱水剂、透明剂和清洗剂，市面上有大瓶包装(500 mL)和小瓶包装(35、18 mL)，对于快速石蜡较多的医院可采用大瓶包装进行仪器统一处理；对于快蜡标本量少的医院可采用小瓶包装进行手工单个处理。不同于以往通过缩短试剂浸泡时长的研究，本研究采用的组织新型快速脱水试剂不仅时间短、步骤少，而且简单易操作、异味小。

本研究共纳入样本40例，其中，实验组有2例样本组织取材过大，固定效果不好，其余38例组织按照组织新型快速脱蜡试剂说明书进行取材，均取得了较好的固定效果，其HE染色评分与常规脱水处理的标本相比，差异无统计学意义。实验组免疫组化、特殊染色结果与对照组相比也不具有差异，说明组织新型快速脱水试剂与常规脱水处理程序相比具有可比性；而在分子检测项目上，两组标本检测的分子标记均定位准确，着色清晰，但实验组的基因信号点清晰度低于对照组，可能是因为对照组在常规取材后即进行分子检测，而实验组在统一收集完样本才进行分子检测，具有一定的时间差，其具体原因待进一步探讨。

综上所述，组织新型快速脱水试剂能缩短组织固定脱水时间，对形态学、抗原表达和核酸定位等的效果均与常规处理相当。