淋巴细胞流式分析应用于细胞生物学实验教学

张晓旭

(天津中医药大学医学技术学院医学实验技术教研室， 天津 301617)

细胞生物学是生命科学、医药研究中的基础学科，是一门应用性、实践性极强的学科。细胞生物学的实验教学环节是本科课程中极其重要的组成部分，有助于学生掌握细胞生物学基础理论知识，训练科学研究技能，提升科学研究素养[1-4]。

细胞生物学实验教学内容的合理设置对于充分发挥教学效果起着基石的作用。设置的课程内容应本着实验与理论相结合，让学生在实验过程中深化对理论知识的理解，同时要兼顾对学生医学技能的培养，顺应科学发展的热潮，不拘泥于传统课程设置，时刻依据科学研究、临床诊断等热门需求对教学内容进行改进[2]。

流式细胞术可对细胞等小颗粒物质进行多参数的高速分析、分选，广泛应用于生命科学与医药领域的基础研究和临床试验，同时也应用于疾病诊断，特别是血液癌变的分析[5-7]。因此，在本科教学中引入流式细胞术的教学对于学生而言，既能初步培养科研素养、提升科研分析能力，又能提前掌握科研或临床应用技能，为学生将来在科研及临床中应用该技术奠定了基础[8]。

1 改革教学方法，将科研及临床诊断实际需求融入教学

由于流式细胞术具有分辨率高、检测细胞数量大、参数多、准确度高等优势，其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学以及临床检验中得到广泛应用。机体免疫状态的检测是临床检验中评价是否患病的重要指标之一，可利用流式细胞术针对各种免疫细胞的形态及表面标志物进行检测，确定各种免疫细胞的数量比例，从而帮助疾病诊断。例如，CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值在健康情况下接近2∶1，在风湿性关节炎患者中则偏高，而在感染HIV的患者体内则偏低[9,10]。

我校在本科教学中充分考虑学生未来科研或工作中的实际所需，针对医学实验技术专业的未来所需不断调整教学内容和教学方法，利用丰富全面的科研平台为教学提供先进的硬件基础，利用演示与实际操作相结合的方式，让学生提早接触掌握科研及工作技能，培养科研兴趣，提升科研素养，例如，对于流式细胞术这一应用广泛的实验技术，也将其有效融入本科教学。以往常见的对培养细胞检测DNA含量分析细胞周期的传统课程在科研中应用相对较少，且为单一标志物，无法让学生切身感受到利用多标志物对不同细胞进行分群的复杂情况。因此，我们调整了课程内容，利用原代提取脾脏细胞让学生接触了解原代细胞的提取方法，利用细胞表面标志蛋白对细胞进行分群分析，标志物的多样性以及荧光的合理搭配使用可以给学生更多的自主选择探索空间，让学生更多接触科研探索过程，避免了过去学生被动接受单一选择的问题。

2 实验教学改革目标

2.1 知识与技能层面

学生掌握流式细胞术的实验原理，理清流式细胞仪的各种分析功能及其应用；初步掌握利用流式细胞仪进行细胞分群的标志物选择原理和方法；了解原代分离细胞的各种方法及适用条件，明确脾脏中的细胞种类。

2.2 过程与方法层面

学生能够独立分析脾脏提取时应选用的原代细胞分离方法，并独立提取小鼠脾脏中的淋巴细胞；结合细胞生物学和免疫学相关知识，通过查阅文献选择可以区分小鼠脾脏T细胞与B细胞的标志物；掌握流式样品制备流程，初步学会使用功能简单的小型流式细胞分析仪(BD，Accuri C6 Plus)并了解参数设置原理以及细胞分群原理。

2.3 情感态度与价值观层面

学生提高对细胞生物学的学习兴趣，培养科研创新意识和提出问题并解决问题的能力，由被动接受学习变为主动解决问题，激发自身的成就感[1,11]。

3 实验设计

3.1 实验原理

脾脏是最大的外周免疫器官，内含大量的T细胞和B细胞，是成熟淋巴细胞定居的场所，是淋巴细胞对血源性抗原产生免疫应答的主要场所。CD19是B细胞受体(BCR)识别抗原过程中关键的信号传递分子，也是B细胞表面特异性标志，可作为免疫治疗B细胞白血病的靶点。CD3是T细胞重要的膜蛋白，通过盐桥与TCR形成TCR-CD3复合物，将TCR识别抗原产生的活化信号转导到T细胞内。除CD19和CD3外，B细胞与T细胞还有很多其他重要膜分子，可供区分B/T细胞及其亚群[12,13]。

3.2 实验仪器与材料

仪器设备包括普通光学显微镜、高速冷冻离心机、流式细胞仪(BD Accuri C6 plus)。材料包括小鼠、解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、35 mm培养皿、移液器、1 ml注射器、70 μm细胞过滤筛网、计数板、15 ml离心管。试剂包括PBS、红细胞裂解液(ACK buffer)、脾脏缓冲液(29.22 mg EDTA加49.5 ml PBS缓冲液溶解，加入500 μl FBS)、单细胞重悬液(29.22 mg EDTA、0.25 g BSA加49.5 ml PBS缓冲液溶解)、4%多聚甲醛、FITC Anti-Mouse CD3 Antibody(Elabscience)、APC Anti-Mouse CD19 Antibody(Elabscience)、75%乙醇。

3.3 实验步骤

3.3.1 脾细胞原代分离 ①取材。学生摘除眼球取血，颈椎脱臼处死，以75%乙醇对皮肤进行表面消毒，解剖小鼠，分离脾脏，放入35 mm细胞培养板中，加入2 ml预冷的脾脏缓冲液备用；②去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪。学生离心管中加入5 ml单细胞重悬液，放一个70 μm细胞过滤器，将脾脏放于细胞筛中，剪开一个小口，取干净的注射器，用其按压处的末端对组织以温和画圆的方式进行碾压。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在离心管中；用PBS清洗细胞筛，收集细胞筛外缓冲液，350 g离心15 min；③去上清。学生加红细胞裂解液2 ml，重悬，冰上孵育4-5 min，偶尔摇晃，加8 ml PBS终止，350 g离心15 min，用PBS 5 ml再次清洗，350 g离心15 min除去上清；④单细胞重悬液重悬500 μl，除去其中不可溶的组织纤维。

3.3.2 流式样品制备 ①取细胞悬液进行计数，调整细胞浓度至106-107cells每毫升；②每份样品吸取100 ul悬液至1.5 ml离心管中；③按表1分组避光加入抗体，4 ℃避光30 min；④加300 ul单细胞重悬液，混匀(若当天无法上机，可加100 ul 4%多聚甲醛+200 ul单细胞重悬液，混匀后4 ℃保存)；⑤混匀细胞悬液过细胞筛，上机分析样品。

表1 实验分组抗体添加情况

3.4 实验结果与分析

图1为经过抗体结合后的小鼠脾脏细胞。由FSC-A/SSC-A图可见，经过机械碾压法可获得大量淋巴细胞；虽然样品经过了红细胞裂解液的处理，但仍有很多红细胞残留，后续实验课可以对红细胞裂解过程进行调整，尝试增加裂解时间；同时样品中也存在较多的细胞碎片，可尝试通过调整细胞离心转速及时间以及洗脱次数来改善。由FITC-A/APC-A图可见，分离获得的淋巴细胞中，T细胞占比约为17.6%，B细胞占比约为67.2%，与理论值T细胞40%，B细胞60%的占比仍有显著的差异[12]。原因可能是通过FSC-A/SSC-A图对淋巴细胞的选取并不精确，其中掺杂了其他细胞。同时可看出，通过机械碾压的方法，对B细胞的获取相对彻底，而T细胞则有较多无法分离获取，这可能与脾脏中T细胞主要集中于PALS，而B细胞主要集中于PALS外侧的脾小结有关[12]。

图1 小鼠脾脏原代分离细胞流式分析结果

本次实验教学改革主要从实验内容以及教学方式上对细胞生物学实验课程进行了改革。从实验内容上，本课程更加贴近学生未来的科研和工作需求，能够更加深入地了解科研及临床上利用率都很高的流式细胞仪的功能和应用，同时本实验不仅涉及细胞生物学的知识，也结合了免疫学相关的知识，让学生充分感受了科研临床上不同学科之间的交叉联系。从教学方式上，我们给予学生更多思考的空间，在进行实验前引导学生思考分离获取细胞的多种方法，从中选取最适合、最简便易行且有效的方法，同时引导学生结合免疫学中学到的相关知识分析思考实验中可能获得哪些细胞，其中占主体会是哪些，确定能够收集到大量淋巴细胞后，又对可以选择哪些标记蛋白来区分鉴定细胞进行思考。

学生在整个实验过程进行了大量思考，也深入掌握了很多原本浮于书本的知识，明显感受到学生的学习积极性被调动起来。实验结束后，学生基本都能够独立完成，且获得较好的结果。同时，由后续学生进入实验室及医疗检测机构实习的反馈可知，本次实验课为学生的实习工作打下了良好的知识及技能基础，真正实现了预期的教学效果。