蛙心灌流实验流程的优化及应用

左 琳，李 圆，郭永强，孙 腾，曹济民

(1山西医科大学基础医学院生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，太原 030001； 2山西医科大学基础医学院机能实验中心)

蛙心灌流实验是医学生理学的经典实验之一，第一个神经递质乙酰胆碱的发现就是通过蛙心灌流实验来进行验证的[1]。奥地利科学家奥托·勒维是该实验的操作者，他分别分离了两只青蛙的心脏，一只保留了迷走神经，而另一只去除了迷走神经。当刺激迷走神经时，与之相连的心脏跳动明显减弱；将该心脏的“任氏液”灌流另一只切断迷走神经的青蛙心脏时，其跳动也明显受到抑制。这一结果提示：切断迷走神经的青蛙心脏受到的抑制效应，应该是来自灌流溶液中的某种化学物质。奥托·勒维推测这种化学物质可能是迷走神经末梢释放的。这个实验的结论支持了迷走神经不是通过“电传递”，而是通过“化学传递”影响心脏功能的观点。这一结论奠定了神经兴奋化学传递学说的实验基础，奥托·勒维因此也获得了1936年的诺贝尔生理学或医学奖。因此，该方法在生理学的发展史上有着里程碑的意义。

目前，许多医学类高校的本科生培养中都采用了蛙心灌流实验，利用该实验可以观察一些理化因素对于离体蛙心功能活动的影响，在生理学的实验教学中有着不可替代的作用。但多年的一线教学让我们发现，蛙心灌流实验的操作流程仍存在一些问题，有待于进一步改进：①学生在结扎入心的静脉时，常因搞不清白线的位置而将静脉窦误扎，这一操作的直接后果将导致心跳骤停，实验宣告失败。②在结扎入心的静脉时，学生需要从两个主动脉干的下方进行穿线，而有些学生误将丝线从一个主动脉干的下方穿过，而从另一个主动脉干的上方穿过，这样操作导致一侧的主动脉干和静脉一起被结扎，进而影响后续的实验进程。③传统实验流程中，学生在右侧主动脉干结扎后，要继续结扎左侧的主动脉干，然后在左主动脉干上剪口，进而做动脉插管[2，3]。在这一系列的操作中，由于左右两侧主动脉干都被结扎，血液流出心脏的通道被完全阻断，心脏的后负荷无限增大。如果学生不及时在动脉上剪口进行压力的释放，心脏将由于长时间无法顺利射血，进而出现心功能下降、对理化物质的反应性减弱等一系列不良反应，严重影响后续实验的顺利进行。④在进行心室插管的过程中，插管尖端要在心室收缩期通过动脉瓣进入心室[4]，这一操作的技术难度较大。由于学生无法看到瓣膜的位置和开闭情况，因此，操作中往往因过度用力而导致瓣膜损伤，甚至心脏穿孔，这也将影响到离体心脏的功能及后续的实验结果。

1 实验操作流程的改进

1.1 牛蛙的抓取、毁髓、开胸、暴露心脏

牛蛙或蟾蜍的抓取及毁髓：教师用左手中指、无名指和小指分别固定动物的前肢和后肢；上抬或下压头部来寻找枕骨大孔的位置(图1A和1B)，位置确定后，用刺蛙针沿枕骨大孔垂直刺入，并向前进入颅腔，捣毁脑组织；向后进入椎管，旋转向下刺入，动物出现下颌呼吸运动消失、四肢肌张力消失时，说明此时毁髓成功。

开胸暴露心脏：教师将毁髓成功的动物仰卧位固定于蛙板上(图1C)；沿剑突下缘做一横切口，并沿胸骨正中线剪开胸骨、暴露心脏(图1D)[4]。

图1 牛蛙的抓取、毁髓及开胸过程

1.2 心室插管前血管的分离、结扎过程

教师分别在左主动脉干和左右两根主动脉干的下方穿线(图2A)，并结扎左主动脉干(图2B)。这一操作过程中，教师不再提前结扎右主动脉干和入心的静脉，这是区别于传统方法的主要操作点之一。

图2 心室插管前血管的分离及结扎

1.3 心室腔插管

教师左手牵拉左主动脉干远心端结扎线，在左主动脉干上剪一鱼嘴型切口；将装有任氏液的动脉插管斜面向下插入左主动脉干内(图3A)，至动脉圆锥根部；此时，将心脏的纵轴方向调整至和插管相平行的位置，在心室收缩期，将插管向下后方插入心室腔内(图3B)；用预留的结扎线将左右主动脉干及动脉插管一同结扎，并在插管侧面的小勾上打结进行二次固定(图3C)，防止心脏滑脱。

图3 心室腔插管

1.4 游离心脏

教师在左主动脉干远心端结扎线的远端剪断血管；将心脏轻轻提起(图4A)，在静脉窦的远心端(白线远端/紫红色跳动区域远端)将心脏与机体分离(图4B)，不再进行静脉的结扎。该方法不宜损伤静脉窦，分离的心脏活性较好。刚游离的心腔中有大量血液，伴随心脏的跳动不断射入插管中(图4C)，教师用任氏液反复洗涤，直至液体清澈透明；将制备好的蛙心标本固定于仪器架上，用蛙心夹在心室舒张期夹住心尖部，调整线的张力至合适的水平(图4D)，即可进行后续的实验内容。

图4 牛蛙心脏标本的游离

2 实验教学效果的评估

我们通过对两种手术操作方法进行数据比较发现：改进方法的手术时间平均为(7.3±0.2)min，较传统方法(14±1.1 min，P<0.01)明显缩短；同时，术后牛蛙心脏的跳动频率在改进方法组为(53.4±1.3)次/min，高于传统方法的(33.8±5.7)次/min(P<0.05)，见图5；而且，采用改进方法分离的蛙心其存活时间最长可达24 h左右。因此，改进后的方法可显著缩短手术时间，提高术后牛蛙的心功能，有利于后续实验的顺利开展。

图5 不同手术方法操作时间及牛蛙心功能的评估

3 不同实验操作方法优缺点的比较

众所周知，蛙心灌流是医学生理学研究中一个经典的实验项目[1，4]。自20世纪初创立以来，该方法一直被很多研究领域及医学教学领域所采用[5-8]，如：研究一些药物对离体心脏功能的影响及可能的机制、医学本科生的实验教学等。

在不断的教学及科研实践过程中，我们逐渐发现传统的蛙心灌流实验流程存在一些不足之处：①结扎入心的静脉时需要两人配合操作，一人用棉球将心脏轻轻推起，另一人要完成入心静脉的结扎，该步骤单人无法完成；同时，如果两人配合不佳，极易导致静脉窦被结扎，心脏会瞬间停跳。即使我们将线结顺利打开，也会因为静脉窦受损，而导致心功能的异常，使后续实验结果出现偏差；②右主动脉干和左主动脉干结扎后，经常由于操作者操作不熟练、不能及时在左主动脉干上剪口并进行插管，那么，高后负荷的长期作用可导致心脏功能下降、心跳频率减慢，进而对后续的实验结果产生影响；③还有一部分不熟练的操作者，在从两根主动脉干的下方进行穿线时，有时误将一根穿在主动脉干下方，另一根穿在主动脉干上方，这将导致结扎静脉时一根主动脉干也被结扎；同时，该操作中结扎线不容易拉到白线下方，使静脉窦被扎的风险显著提高。

针对实践中发现的一系列问题，我们进行了大胆尝试，对该流程中容易出错的环节进行了优化。①操作者不再结扎静脉窦。静脉窦是蛙类心脏的正常起搏点，与人体窦房结的功能一致。操作者如果在实验操作中不小心结扎，将可能导致心跳停止，因此，这是蛙心灌流操作中相对比较重要的步骤之一。通过实验改进，操作者不再进行静脉窦的结扎，在蛙心插管完成后，直接从静脉窦远端游离心脏，这一操作比结扎相对容易，可一人完成；且静脉中血液向心方向回流，直接剪断不会引发出血。②操作者不提前结扎右主动脉干。传统方法是操作者在插管前要结扎出入心的所有血管，这一操作可导致心脏的后负荷骤然增加，心功能急剧下降；为了避免出现上述的问题，改进后的流程只结扎左主动脉干远心端，然后在主动脉干上剪口、插管，最后将左右主动脉干连同插管一同结扎。此操作的优点在于插管时，右主动脉干的血流依然畅通，因此，心脏后负荷的变化不大，操作对蛙心功能的影响很小，有利于后续实验的顺利进行[8]。③操作者调整插管的角度和心脏纵轴相平行。蛙心插管是该实验的核心步骤，也是多数操作者失败的关键步骤。通过多年实验的摸索，我们发现：将蛙心插管的尖端调整至朝向心尖的方向，在心脏射血的同时向下后方轻挑，即可将插管送入心室内。借助这一小的技巧，插管的成功率极大提升。④通过以上几个关键步骤的改进，操作者极大缩短了蛙心插管流程的操作时间，提高了操作的稳定性，减少了失误率。分离的心脏功能活动明显优于传统方法分离的心脏。同时，该流程只需要两根棉线，使流程简便的同时也节约了实验成本。

虽然改进后的实验流程从操作性、稳定性、成功率等方面都优于传统方法，但是也有不足。实验中，操作者由于没有结扎入心的静脉，因此，在操作过程中，仍有血液向心回流，导致心腔中的血液比较多；在插管完成、心脏游离后，需要对心腔的血液进行多次冲洗，直至血液被完全去除，才可进行后续的实验。

综上所述，通过以上流程的改进，医学本科生在进行实验操作时，可以快速、准确地掌握蛙心灌流的基本步骤，成功分离出活性较高、反应性良好的心脏标本[8]。本文建立了一套较为完善可靠的插管方法，不仅有助于蛙心灌流实验教学的顺利进行，同时对相关科学研究也有一定的参考价值。