县级兽医实验室做好抗体检测的经验分享

刘青彦，王启佩

（1.河南省舞钢市动物疫病预防控制中心，河南 舞钢 462599；2.河南农业大学）

发展畜牧业，动物疫病防控是关键，而免疫接种已经成为目前防控动物疫病的首选措施，因而免疫效果监测就显得尤为重要，它便于我们准确了解动物疫病的发生、传播和流行情况，掌握畜禽规模养殖场的免疫抗体水平和动物疫病保护情况，还能帮助养殖场（户）建立科学的免疫程序，考核免疫效果，评价疫苗质量，以及帮助我们科学、公平、客观评价动物防疫质量，对重大动物疫情科学预警预报提供重要依据，因此，做好免疫抗体检测对畜牧业健康快速发展有着十分重要的意义。

县级兽医实验室的抗体检测对象主要包括猪、牛、羊、鸡等，猪、牛、羊的抗体检测主要通ELISA 试验来完成，鸡的抗体检测通过HA/HI试验来实现，因HA/HI试验的步骤较为复杂，影响结果准确性的因素较多，且每份样品就有四项（即新城疫、禽流感H5N1-11、H5N1-12、H7N9）抗体需要检测，笔者从近20 年的检测工作中总结出了一套使试验结果准确、快速、高效的措施，该文仅就鸡的抗体检测（HA/HI试验）加以阐述。

1 做好试验前的准备工作

1.1 制备合格的血清

要求待检血清清亮、无腐败、无溶血，且编号正确，不重不漏。

1.2 准备好试验所需的试剂、器材等物品，并摆放到位

准备好试验所需试剂如：新城疫/禽流感分型标准抗原、PBS 液（笔者所在实验室常用新开启的生理盐水代替）、1%红细胞悬液等，以及加样槽、一次性V型塑料反应板、适宜量程的移液器及适配滴头等物品，并将试验所需的滴头装进滴头盒备用；且将反应板做好标记，横竖各标上1.2.3.4…，将这些连同废弃物桶、消毒药及试验所需防护用品如一次性手套、口罩等通通准备好且摆放到位。

1.3 将待检血清添加到血清稀释板

将每份待检血清（约200 ul）按编号顺序依次添加到血清稀释板上并在该板边缘的特定位置及对应的板盖上做好标记，如：一、二、三…（即第一板、第二板、第三板…）。

这一步是使试验快速、高效的最重要的一步，这样做可以使鸡的四项抗体检测中的每一项的HI试验中加血清这一步都可以用八道移液器直接从相应稀释板的相应列中吸取，一列的八份样品刚好可以用八道移液器移到相对应的反应板上做一板，这避免了每做一项试验均需从装样品的离心管中吸取样品到反应板中这一繁琐步骤，这使得试验速度大大提高。

2 准确把握试验过程的每个技术要点

2.1 配制合格的1%红细胞悬液

此过程需要强调的是：①一定要采集至少三只未经免疫的健康公鸡的血；②采血过程一定加抗凝剂防止凝血；③洗涤红细胞时离心机转速应设定在1 000～2 000 转/分钟较为合适，转速切不可设置太高，若太高，红细胞压得太实会影响其功能甚至导致红细胞碎裂；④采集的红细胞应无污染，否则可能导致非特异性反应而影响试验结果；⑤洗涤及配制1%红细胞一定要用生理盐水或PBS 液，切不可错用成纯净水或蒸馏水，否则可能因渗透压差导致红细胞崩解破坏；⑥配制1%红细胞的PBS 液pH 值需调至7.2最合适。

2.2 做好HA试验，准确测定抗原效价

HA试验步骤如下：①在96孔V型微量反应板中每孔加25 ulPBS；②从第1 孔加25 ul抗原或病毒液，反复吹吸3到5次混匀；③第1孔吸取25 ul抗原或病毒液，加入第2孔，混匀后，吸取25 ul加入第3孔，进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取25 ul弃去，第12孔为PBS对照孔；④每孔加入25 ulPBS；⑤每孔加入25 ul1%体积分数鸡红细胞悬液；⑥结果判定：轻扣反应板混合物，室温（约20℃），静置40 min，环境温度过高时可在4℃条件下静置60 min，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。判定时，将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠状流淌（100%凝集）的最高稀释倍数判为该抗原的血凝效价。

HA试验要点为：①加抗原时一定要先润湿滴头内壁；②抗原倍比稀释过程中滴头以伸入液面下2～3 mm为宜；③移液器加样时应垂直悬空；④加红细胞时应先摇匀再加；⑤在反应板上最好做三排，然后取结果相同的那两排效价定为抗原效价，此步骤是整个试验的关键，抗原效价测定的准确性直接影响所测血样抗体效价的准确性。

2.3 根据抗原效价准确配制4HAU的病毒抗原

根据HA 试验测定的效价配制4HAU 的病毒抗原。4HAU抗原应根据检验结果调整准确。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU=256/4=64（即1：64），取PBS 6.3 ml，加抗原0. 1ml，即通过1：64获得4HAU。先计算该实验所需4HAU 抗原的量，然后根据计算结果进行配制。为保证所配4HAU抗原的准确性，通常还要进行4HAU抗原校正。

2.4 把握好HI试验的技术要点，准确测定血清抗体效价

HI试验步骤如下：①根据HA试验测定的抗原效价配制4 个血凝单位（即4HAU）的病毒抗原，4HAU 抗原应根据检验结果调整准确；②第1孔至第11孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS作为空白对照；③第1孔加入25 μL血清，第一孔血清与PBS充分混匀后吸取25 μL于第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25 μL弃去，第11孔作为抗原对照；④第1～11 孔均加入25 μL 4HAU 抗原在室温（约20℃）下静置30 min或4℃下静置60 min；⑤每孔加入25 μL 1%体积分数鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（约20℃）下静置40 min或4℃下静置60 min，空白对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果；⑥结果判定：当抗原对照孔（第11孔）完全凝集且阴性对照血清抗体效价不高于1 ∶4，阳性对照血清抗体效价与已知效价差不超过1个滴度时试验方可成立。以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。

HI 试验过程需掌握如下要点：①操作熟练、规范，加样仔细、认真，不跳孔、不串孔；②使用移液器时要垂直悬空，倾斜度最好不超过10°；③加样剂量准确，动作要求快、准、稳；④样品倍比稀释过程中移液器滴头必须伸入液面以下（以2～3 mm 为宜），以免产生气泡；⑤每次加红细胞前必须先将其摇匀，加后再轻震反应板；⑥每加一种样品都要更换滴头。

2.5 其他措施使结果更准、使试验更快速、高效2.5.1 划分“功能区”

将实验台面划分成六个功能区：加生理盐水区、倍比稀释区、加4HAU抗原区、加红细胞区、震荡区及结果判定区。这有效避免了加样过程中的错加、漏加。

2.5.2 固定移液器

“固定移液器”即每个移液器在相对固定的时间段只加某一种样品，即某个移液器在相对固定的时间段加生理盐水的只加生理盐水，加抗原的只加抗原，这不仅有效避免了因忘记更换滴头导致的错误，更避免了因频繁更换滴头造成的浪费，从而大大节约了滴头。

3 结论

通过以上这些措施，不但实验结果准确性得到了充分的保证，还大大节省了试验所需的时间，原来需要3～4 d才做完的试验，现在可以在1 d内搞定，这在春秋集中免疫后的集中抗体检测时，因有大量血样等待检测，且每份样品都有四种抗体需要检测时的效果尤其凸显。同时试验材料消耗及废弃物的处理成本都大大降低。再者，因为试验时间大大缩短，所配4HAU 抗原效价基本不变，所配红细胞还依然保持强劲活力，从而使试验结果更准确。□