循环肿瘤DNA 在卵巢癌诊治中的研究进展

于长清，汪希鹏

卵巢癌（ovarian cancer，OC）起病隐匿，治疗困难，复发率高，据统计，2020 年全球OC 新发患者31万余例，死亡20 余万例，病死率居妇科恶性肿瘤首位[1]。OC 患者在疾病早期一般无明显症状，而当临床症状如腹胀、腹水和肠道梗阻等出现时，多已为晚期。尽管早发现早治疗能明显改善OC 患者的预后，但80%的OC 患者初次诊断时已是Ⅲ期或Ⅳ期[2]。目前OC 诊治仍依赖于血清学、影像学方法及病理检查结果，这些方法在OC 诊治过程中各有局限，糖类抗原125（CA125）和影像学检查在用于肿瘤监测时缺乏时效性，而组织病理检查受到取材部位和取材次数限制，因此，需要探索新的诊断和监测OC 的有效方法。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作为一种新的检测手段，具有无创、不受检测次数限制、可反映肿瘤负荷和肿瘤异质性等优点，在OC 诊治中的临床应用价值正在逐步体现。尽管ctDNA 在OC 诊治中的研究仍处在早期阶段，越来越多的研究表明ctDNA 在OC 诊治中具有巨大潜能，但同时也存在许多争议。现综述ctDNA 在OC 诊治中的研究进展，展望ctDNA 在OC 诊治中的研究方向，以期能为OC 诊治开拓新的视野。

1 ctDNA 概述

1.1 ctDNA的生物学特性 ctDNA 通常指外周血中细胞外游离的肿瘤细胞来源的片段状DNA，仅占细胞外游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的很小部分，1989 年Stroun 等[3]首次证明了ctDNA 的存在。其分解主要靠核苷酸酶，清除主要靠肾脏排泄，半衰期极短，一般在16 min～2.5 h 之间。外周血中ctDNA 的含量极低，且ctDNA 含量及其与cfDNA 的比例也不固定，这归因于患者所患疾病的类型、疾病所在的期别表现出明显的个体化差异，并受到多种内外界因素影响，如急性应激、创伤、手术、炎症、年龄和体力活动等。尽管ctDNA 含量在不同患者中差异很大，但对同一个体而言，ctDNA 含量高低与肿瘤负荷大小存在着明显的关联[4]。ctDNA 和cfDNA 常与液体活检联系在一起，但是液体活检的标志物不仅局限于这两者，还包括染色体、RNA[信使RNA（mRNA）、小干扰RNA（siRNA），微小RNA（miRNA）]、蛋白质、外泌体，甚至循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。液体活检的样本来源也不局限于外周血，亦可以是尿液、肠液、唾液、脑脊液和胸腹水等。

1.2 ctDNA的获取 血清中的ctDNA 含量高于血浆，但在血清制备过程中会导致白细胞裂解，释放的DNA 会降低cfDNA 中ctDNA 的比例，影响检验的敏感度。因此，ctDNA 提取检测一般选择血浆而非血清。某些体液标本在诊断特定部位疾病时较血浆更佳，如尿液用于膀胱肿瘤检测，脑脊液用于中枢神经系统肿瘤检测。由于ctDNA 的半衰期短，为减少ctDNA 降解，血液标本需置于4 ℃保存，并在4 h 内进行血浆分离[5]。使用细胞固定液能稳定细胞膜，减少细胞裂解，使样本在室温条件下保存数天，为样本转运、储存提供时间。另外，为防止血液凝固必须使用抗凝剂，由于肝素化的血浆可能阻碍后续聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）过程，目前乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）是首选的抗凝剂。ctDNA 的分离可选择吸附柱法、磁珠法和相分离法等，其中苯酚-氯仿分离法分离出的ctDNA 分子质量范围更大[6]。含量低、半衰期短的特点使ctDNA 提取过程会对检测结果造成很大影响，目前在提取和纯化ctDNA 方面尚无统一的标准。

1.3 ctDNA的检测 ctDNA 的检测方法主要分为2种：以PCR 为基础的检测方法和二代测序（next generation sequencing，NGS）。基于PCR 的方法主要有等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，ASPCR）、数字PCR（digital PCR，dPCR）和BEAMing PCR。AS-PCR 选择特异性的引物对目标基因进行扩增，主要用于热点突变基因和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测，其检测精度可达到0.1%～1%[7]。dPCR 方法通过单分子模板PCR 扩增能够对DNA 分子进行计数，达到很高的敏感度，但不适合高浓度DNA 样本检测。由dPCR 发展而来的IBSAFE 技术是一种超敏液滴数字PCR（ultra-sensitive droplet digital PCR，ddPCR），能检测到OC 患者中突变频率仅为0.006 8%的TP53 基因突变[8]。BEAMing PCR 因珠子（Bead）、乳剂（Emulsion）、扩增（Amplification）、磁力（Magnetic）4 个因素而得名，BEAMing 技术结合dPCR 和流式技术，能够对突变进行定量检测，敏感度高。基于PCR 的检测技术都只能对已知突变进行测序，不能检测未知突变，而NGS 则可通过靶向或非靶向的DNA 测序检测所有异常突变。非目标靶向测序NGS 主要有全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和全外显子测序（whole exome sequencing，WES）。由于其检测没有目标基因，价格昂贵，检测深度和检测敏感度方面不如靶向测序方法，故实际应用较少。靶向测序NGS 是针对特定基因或特定序列的检测，主要包括扩增子靶向测序（tagged-amplicon sequencing，TAm-Seq）、安全测试系统（safe sequencing system，Safe-SeqS）和肿瘤个体化深度测序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。其中Safe-SeqS 是在被扩增DNA 上标记1 个特有的标签后进行扩增，以标签为定位对扩增出来的DNA 进行分析，出现频率大于95%的基因突变才被认为是真正的突变，使检测误差降低至0.02%[9]。近年应用于NGS 的数据统计模型也在发展，例如由PyClone 改进而来的PyClone-Ⅵ，在保证准确率的情况下显著提高了检测效率[10]。

2 ctDNA 在OC 诊治中的应用

2.1 OC诊断 在OC 早期诊断和疾病筛查方面，目前仍缺乏有效的检测手段。2021 年英国卵巢癌筛查联合试验（the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening，UKCTOCS）的研究结果数据显示，CA125 筛查对1 年内OC 的诊断敏感度为71%，而阴道超声检查的敏感度仅为61.5%[11-12]。ctDNA 在其他类型肿瘤如乳腺癌、肺癌、膀胱癌和结直肠癌的早期检测中的应用已初见成效，研究已表明ctDNA 亦可被用于OC 检测。Kamat 等[13]采用实时PCR 通过GAPDH、β-肌动蛋白（β-actin）和β-球蛋白（βglobin）3 个基因位点的检测来测定晚期OC 患者血浆cfDNA 的含量，结果显示OC 患者cfDNA 含量较健康对照组升高（P 分别为0.022、0.025 和0.008 9）。另外，无创产前诊断（noninvasive prenatal testing，NIPT）技术不仅可以用于产前诊断，也能检测出OC患者外周血染色体数目变异。Cohen 等[14]使用NIPT技术对32 例OC 患者和32 例卵巢良性肿瘤患者外周血染色体和亚染色体拷贝数进行了检测，通过与已报道的OC 染色体拷贝数变异（copy number variations，CNV）数据对比发现，在32 例OC 患者中有13 例存在CNV，而在良性肿瘤组中仅有2 例存在CNV。Wang 等[15]采用Safe-SeqS 对83 例OC 患者血浆ctDNA 样本中18 个肿瘤相关基因突变状态进行了检测，33 例患者结果显示阳性，采用同样方法检测了254 例患者宫颈涂片样本和51 例患者宫腔涂片样本，阳性率分别为29%和41%。

研究已证实ctDNA 不仅可应用于OC 高风险者的筛查，其用于OC 诊断时较传统方法更优。2017 年Vanderstichele 等[16]首次将ctDNA 低覆盖全基因组的z 评分结果用于OC 的检测，68 例附件肿块患者的测试结果显示z 评分用于高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）诊断时，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.89，高于CA125（AUC=0.78）和恶性肿瘤危险指数（the risk of malignancy index，RMI，AUC=0.81）。Widschwendter等[17]将特制基因芯片应用于OC 诊断，该基因芯片能同时检测ctDNA 中COL23A1、C2CD4D 和WNT6这3 个OC 特异性的甲基化异常基因，对43 例OC患者血浆ctDNA 样本测试的结果显示，该基因芯片对OC 诊断的敏感度为23.3%，特异度为96.9%。该研究中19 例患者样本取自临床确诊前1 年内，24例患者样本取自临床确诊前1～2 年，提示ctDNA 检测能将OC 的诊断时间明显提前。Li 等[18]统计了22项研究中的OC 患者数据后发现，ctDNA 对OC 的综合诊断敏感度达73%，特异度达90%。另外，用于OC 检测的新靶点也在研究中。Zhang 等[19]发现OC患者血浆ctDNA 中的ALU-219 含量明显高于良性肿瘤患者和正常人，ALU-219 联合ALU-219/ALU-115 预测OC 的AUC 为0.792。2019 年Dvorská 等[20]对128 例OC 患者血浆样本中4 个抑癌基因（RASS1、PTEN、CDH1 和PAX1）甲基化程度进行检测后发现，OC 组的CDH1 甲基化百分率高于健康对照组，差异有统计学意义[（46.42±20.91）vs.（22.25±14.13），P＜0.05]，这表明CDH1 有望成为OC 无创检测的靶点之一。

2.2 肿瘤分子分型ctDNA 检测方法可以对肿瘤基因进行全方位的检测，发现肿瘤相关基因突变和异常的基因改变。目前，组织学检查仍是肿瘤分子分型的金标准及后续药物治疗方案选择的主要依据；然而组织活检技术有很大的局限性，如取材范围不全面、取材次数有限和样本无法获取等。而且由于肿瘤异质性的存在，单一部位取材的结果往往难以全面反映肿瘤特性。ctDNA 检测可以弥补组织学检查的不足，做到对各个部位肿瘤细胞释放到外周血中的ctDNA 进行集体活检，其检测结果更能反映肿瘤的异质性。

已有研究表明ctDNA 检测结果与组织学检测结果有较高的一致性。Chan 等[21]在罹患OC 和乳腺癌患者的血浆中能同时检测到各自特异性的基因拷贝数畸变，表明ctDNA 用于OC 肿瘤异质性检测可行并具有特异性。在OC 患者中，2 项对于TP53 基因突变检测研究的结果显示ctDNA 检测结果与组织样本检测结果一致性分别为100%和76.19%，对于BRCA1 检测的特异度达100%，与组织学检查结果一致性达95.24%[22-23]。Christie 等[24]对30 例BRCA1或BRCA2 胚系突变的OC 患者的肿瘤组织标本和血浆ctDNA 进行检测后发现，肿瘤组织BRCA 回复突变（reversion mutations）阳性的5 例患者中有3 例ctDNA 检测结果同样阳性，ctDNA 检测敏感度为60%，特异度为100%。另一方面，Arend 等[25]对14 例OC 患者新辅助化疗前后组织与血浆样本中的突变基因进行检测后发现，在肿瘤组织中，化疗前6 个基因的38 个突变位点中，有33 个突变位点在化疗后未发生变化；而在血浆ctDNA 中，化疗前后ctDNA检测结果的差异明显，化疗后检出的54 个突变位点与化疗前检出的59 个突变位点相比，仅有6 个相同。Jagelkova 等[26]研究发现ctDNA 检测结果与组织学检测仅有33.3%的一致性。因此，ctDNA 能否真实反映肿瘤异质性、其与组织学检查是否具有一致性仍存在争议，需要进一步研究。

2.3 残存病灶检测和复发监测ctDNA 作为一种检测手段可用于OC 残存病灶检测和复发监测。肿瘤残留病灶大小与OC 患者的预后有关，2006 年有研究证明在动物模型血浆中肿瘤特异性的ctDNA与OC 肿瘤质量大小呈正相关（R2=0.81，P＜0.01）[27]。2016 年Parkinson 等[28]检测了12 例OC 患者治疗前血浆ctDNA 样本中TP53 等位基因突变比例（TP53 mutant allele fraction，TP53MAF），分析TP53MAF 与CT 影像检查测得的肿瘤体积的相关性后发现，在复发性OC 组，肿瘤体积每增加1 cm3，TP53MAF 增加0.04%；在初次诊断OC 组，肿瘤体积每增加1 cm3，TP53MAF 增加0.000 8%。进一步分析药物治疗后TP53MAF 下降幅度与复发时间之间的关系发现，TP53MAF 下降＞60%表示预后良好，以TP53MAF下降≤60%来预测6 个月内复发与否，预测的敏感度为71%，特异度为88%。该研究证实了ctDNA 可以监测OC 复发。2020 年Noguchi 等[29]发现治疗前血浆中ctDNA 含量高的OC 患者，无进展生存期（progression free survival，PFS）更短（P=0.01）。另一方面，Paracchini 等[30]分析46 例高级别浆液性OC 患者数据后得出相同结果，初次确诊时ctDNA 含量比例较高组的PFS 短于ctDNA 含量比例较低组（14.7 个月vs.18.4 个月，P=0.02）；同时发现在采用了ctDNA来监测疾病的19 例OC 患者中，ctDNA 比CA125 预测的复发时间平均提前240 d。

2.4 评估药物治疗反应性ctDNA 半衰期短，其含量与肿瘤质量大小有关，在反映药物治疗效果时具有独特的优越性。Alves 等[31]对11 例晚期转移性OC患者化疗过程中的血浆ctDNA 进行了系统性监测，通过分析发现，第1 个化疗周期结束后ctDNA 含量升高患者组较不升高患者组，化疗达到部分缓解及完全缓解的比例更高（80%vs.16.6%，P=0.035），PFS获益更大（P=0.007 4）。Kim 等[22]通过对比28 例OC患者治疗过程中TP53 等位基因突变数目（TP53 mutant allele count，TP53MAC）和CA125 水平变化，发现在手术和化疗后TP53MAC 和CA125 水平均明显下降，分析术后和每次化疗后两者下降百分数发现，两者下降趋势具有一致性，仅在首次化疗后两者下降幅度差异有统计学意义（11.7%vs.29.1%，P=0.011）。OC 患者的ctDNA 基因检测结果可用于预测药物治疗效果及指导临床用药。Du 等[23]的研究发现，ctDNA BRAC2 N372H 多态性检测阳性的4 例OC患者均出现了耐药复发（PFS＜6 个月），而检测阴性的患者中仅有35.3%（6/17）出现了耐药复发。Rusan等[32]检测了BRCA 突变的OC 患者ctDNA 中同源框基因A9（HOXA9）启动子甲基化状态，发现在维利帕利（Veliparib）治疗3 个疗程后HOXA9 启动子甲基化的患者结局更差。Vidula 等[33]在9 例实体肿瘤患者的ctDNA 中检测到了BRCA 回复突变，9 例患者均出现了耐药性，其中7 例在检测之前使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制剂治疗。Lin 等[34]对97 例BRCA 阳性的复发OC 患者ctDNA 进行BRCA 回复突变检测，发现在铂难治和铂耐药复发患者中BRCA 回复突变比例分别为18%和13%，而在铂敏感患者中仅为2%，后续使用卢卡帕利（Rucaparib）治疗，无BRCA 回复突变组PFS 明显高于回复突变组（9 个月vs.1.8 个月，P＜0.000 1）。

3 结语

OC 作为主要生殖系统恶性肿瘤之一，缺乏有效预防措施，在筛查和早期诊断方面缺少有效检测手段，其对女性生命健康的威胁正在增大。ctDNA 作为一种新的生物标志物，在OC 诊断、治疗和预后等方面的研究已初步显示其优越性。但目前在OC 长期管理过程中，CT 等影像学检查方法和肿瘤标志物CA125 仍是监测OC 复发的主要手段。然而随着医学的发展，传统检验方法的不足之处逐渐暴露，不能满足临床工作的需求。ctDNA 在临床诊治过程中有着广阔的应用前景，未来有望成为OC 诊疗管理过程中一种补充或替代现有检测方法的新方案。但目前ctDNA 提取检测标准尚未统一，对ctDNA 认识存在不足，ctDNA 在OC 诊治中应用的研究证据尚不充分，致使ctDNA 在OC 临床应用过程中仍面临诸多障碍。未来需要对ctDNA 进行更深入的研究，也需要更多的临床研究来验证其临床应用价值。