巨噬细胞在子宫内膜异位症神经纤维及血管生成中的作用及机制

梅珊珊，丁杰，倪喆鑫，程雯，俞超芹

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是指具有功能的子宫内膜细胞出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层外，表现为慢性盆腔痛、卵巢子宫内膜异位囊肿、不孕等的雌激素依赖性疾病[1]。EMs 在育龄期女性中的发病率为10%～15%，在慢性盆腔痛的患者中占5%～21%[2]。EMs 的发病机制非常复杂，众说纷纭。有研究发现，在EMs 疾病进展过程中炎性微环境的形成是引起神经纤维和血管生成、粘连形成和周围组织纤维化的主要原因[3]。而EMs 巨噬细胞的募集和功能改变引起内皮细胞的迁移和新生血管形成，并使病灶内神经纤维异常生长和分布是促进疾病进展的重要机制[4]。因此，探讨EMs 巨噬细胞对神经纤维及血管形成的作用及其机制具有重要意义。针对巨噬细胞与EMs 神经血管生成的靶向治疗可以干预炎症过程和周围神经及血管的生成，从而缓解EMs 的进展。现就巨噬细胞在EMs 神经纤维及血管形成中的作用及其潜在机制进行综述，为解析EMs的发病机制提供新的思路。

1 EMs 神经纤维及血管生成

1.1 EMs异位病灶神经纤维的形成及分布 EMs最典型的症状是慢性盆腔痛。而在大多数EMs 异位组织中都可以观察到异常的神经纤维支配，包括完整神经纤维总数和感觉神经纤维增加、交感神经纤维密度降低及胆碱能和无髓神经纤维的出现[5]。患有深部浸润性EMs 和肠道EMs 的女性盆腔疼痛症状更为明显，而其异位病灶的神经纤维密度明显高于腹膜异位病灶和卵巢异位病灶[6]。EMs 慢性盆腔痛的产生过程中，中枢神经系统中伤害性感觉神经元的过度兴奋是其重要机制之一。目前越来越多的证据表明，在共有的感觉神经通路中会发生神经系统的慢性重塑，从而导致EMs 患者慢性盆腔痛的中枢敏化和慢性疼痛状态延长[7]。

神经生长因子是一种神经营养因子，在侵袭性病变中的表达明显高于非侵袭性病变，其在EMs 异位病灶中也异常升高[8]。神经生长因子通过激活肥大细胞脱颗粒和产生细胞因子参与持续性的炎症疼痛过程[9]。而炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor -α，TNF -α）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），可促进神经生长因子在异位病灶中的表达[10]。因此，EMs 异位病灶与神经纤维生成之间通过炎症介导相互作用，神经纤维的生长对于EMs 相关性疼痛的产生可能发挥着重要作用。

1.2 EMs的血管生成 EMs 的病灶起源于逆流的子宫内膜细胞，与其他组织类型相比，子宫内膜的血管形成在月经周期中经历明显的动态变化，这与增殖期雌激素驱动的血管生成和分泌期孕激素驱动的血管成熟有关[11]，因此异位病灶的血管生成也受女性性激素的复杂调控。而异位病灶的生长需要建立相应的血管网以提供其生长所需的营养和氧。缺氧状态可使得血管生成因子水平急剧上升而促进血管生成[12]，另外异位病灶迅速建立自身的血液供应系统，也是其成功种植和长期存活的前提。研究发现EMs异位病灶中血管通透性明显增加，并出现大量新生血管网[13]。因此血管生成是EMs 的重要特征之一。

EMs 异位病灶血管生成的调节与介导肿瘤转移及病理性血管生成的机制有许多相似之处，而缺氧是血管生成因子上调的最强诱导因素之一[14]。有研究表明，缺氧可抑制双特异性磷酸酶2（dual specificity phosphatase-2，DUSP2）活性从而促进IL-8的表达，IL-8 可促进血管生成[15]。而EMs 炎性微环境会导致促血管生成因子与抗血管生成因子平衡的打破，促进EMs 病灶中微血管网的建立[16]。有研究发现EMs 存在多种促炎因子（如IL-10、IL-17A 和IL-33等）的异常表达，而这些促炎因子可促进异位内膜细胞的增殖和血管生成[17]。因此，EMs 炎性微环境与异位病灶的血管生成密切相关。

2 EMs 巨噬细胞的功能改变

2.1 EMs巨噬细胞的表型变化 在EMs 患者激活的免疫微环境中，巨噬细胞是参与免疫应答最多的免疫细胞，其表型和功能与健康妇女比较均发生了明显改变。巨噬细胞主要有2 种活化途径，即经典激活（classical activation，M1）途径以及替代激活（alternative activation，M2）途径。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）或降解的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分可诱导M1 型巨噬细胞的形成。M1 型巨噬细胞的主要表面标志物为人类白细胞DR 抗原（HLA-DR）、CD197 和CD11c 等，可高表达IL-12 和IL-23，同 时也能分泌TNF-α、IL-1β、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）。M1 型巨噬细胞可促进1 型辅助性T 细胞（Th1）型细胞因子相关的反应，参与抗原提呈、促进炎性反应和病菌清除。IL-4、IL-13、IL-33 和免疫复合物等可诱导形成M2 型巨噬细胞。M2 型巨噬细胞一般高表达CD163和CD206，并大量分泌转化生长因子β（transforming growth factor -β，TGF -β）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）等，同时上调血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等的表达，促进Th2 型细胞因子相关微环境的形成[18]。M1和M2 型巨噬细胞具有不同的功能和转录特征，M1、M2 型巨噬细胞的比例变化决定了炎症或组织损伤的转归。根据活化因子的不同，M2 型巨噬细胞可进一步分为4 个亚群，即M2a、M2b、M2c 和M2d[19]。巨噬细胞M2a 亚群可由IL-4 和IL-13 诱导，并产生高水平的CD206、IL-1Ⅱ型受体（IL-1RⅡ）和IL-1 受体拮抗剂（IL-1Ra）。M2b 亚群可以通过免疫复合物（immune complex，IC）和Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂或IL-1Ra 配体的刺激来诱导，其能产生抗炎因子IL-10 和促炎细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α。M2c 亚群由糖皮质激素和IL-10 诱导，并通过释放大量TGF-β 下调TNF-α 的表达而表现为抗炎作用。TLR 激动剂通过腺苷受体诱导M2d 亚群的生成，该亚群分泌大量的抗炎细胞因子，其表达特点为低IL-12 和高IL-10，并分泌VEGF，具有肿瘤相关巨噬细胞（tumor -associated macrophages，TAM）特征的促血管生成特性。

EMs 患者盆腹腔最初可能呈现为抗炎微环境，有大量M2 型巨噬细胞、调节性T 细胞（Treg）和Th2分布，并有自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）功能的缺失，此种免疫微环境有利于异位的内膜细胞免疫逃逸，并在盆腹腔内种植。在EMs 疾病发展初期，促炎免疫群体被激活，此时M1 型巨噬细胞占优势，而随着疾病的进展，M1 型巨噬细胞逐渐减少，M2 型巨噬细胞比例呈现急剧上升状态，并且从Ⅰ期到Ⅳ期逐渐增加，形成以M2 型巨噬细胞为优势的免疫微环境，促进血管生成和粘连形成，并抑制其他免疫细胞对异位内膜细胞的清除作用，形成适宜的炎症微环境，促进EMs 的发展[20]。

2.2 EMs巨噬细胞的功能变化 在EMs 中，巨噬细胞的异常聚集是最主要的免疫反应。早有研究表明，EMs 患者免疫微环境中活化的巨噬细胞数量和其产生的细胞因子水平较正常女性显著增加[21]。活化的巨噬细胞可以通过吞噬作用来调节相关免疫反应。巨噬细胞通过吞噬作用可以清除红细胞、受损组织碎片和细胞碎片，或者通过产生可溶性介质，如细胞因子、前列腺素、补体成分和酶，诱导炎症的产生、损伤组织的修复和新生血管的形成，并可能有利于成纤维细胞和内皮细胞的募集[22]。巨噬细胞衍生的细胞因子还可以刺激其他免疫细胞如T 和B 淋巴细胞的活化。尽管巨噬细胞活化增加，但EMs 患者腹腔液巨噬细胞的吞噬活性却是降低的，导致其不能清除随经血逆流至腹腔的子宫内膜细胞。巨噬细胞的吞噬作用受CD36 受体的表达和基质金属蛋白酶的激活调节，而CD36 受体的表达和基质金属蛋白酶的激活可被前列腺素E2 抑制。相关研究显示，EMs 患者腹腔液、异位病灶前列腺素E2 水平显著升高[23]。腹腔巨噬细胞对异位内膜细胞的清除功能有赖于其对ECM 的黏附作用，而EMs 患者腹腔液中非黏附性巨噬细胞增多，提示其清道夫功能存在缺陷，这可能是导致异位内膜细胞不能被免疫清除的原因之一。除了巨噬细胞吞噬能力的降低之外，逆流入腹腔的子宫内膜细胞数量过多，超出了巨噬细胞清除能力，也可能导致EMs 的发生、发展。

3 EMs 巨噬细胞对神经纤维及血管生成的作用

众所周知，EMs 最典型的临床表现是EMs 相关性盆腔痛，而导致其疼痛的原因可分为4 种，分别是伤害性、炎性、神经性或混合性。而形成EMs 相关性盆腔痛的机制与神经纤维、血管的生成密不可分。有研究发现，外源性VEGF-A 可以同时作用于血管和神经元，既可以在信号蛋白3A 的调节下促进交感神经突起的生长，亦可以通过视交叉和脊髓促进导向轴突的形成。神经生长因子也可同时作用于神经元和血管，其可刺激人脐静脉、脉络膜和真皮微血管内皮细胞的增殖[24]。

3.1 EMs巨噬细胞与神经纤维的交互作用 炎症微环境的形成和神经纤维的生成是与EMs 发生、发展密切相关的两个主要因素。在雌二醇的作用下神经纤维分泌趋化因子CCL2 和集落刺激因子1（colony stimulating factor-1，CSF-1），它们招募巨噬细胞，并促进其分泌神经营养蛋白3 和脑源性神经营养因子，刺激神经纤维生成[25]。EMs 的炎症微环境刺激外周神经末梢，激活的神经纤维也分泌促炎性神经介质，引起外周神经炎症，导致疼痛的产生。

Greaves 等[26]研究显示，EMs 巨噬细胞引发的炎症和神经纤维释放的促炎肽可能在巨噬细胞和神经纤维之间形成恶性循环，是维持和加重炎症，诱发疼痛的机制。而巨噬细胞分泌的多种细胞因子亦可刺激外周神经，使其致敏。其中巨噬细胞分泌的TNFα 和趋化因子CCL2 的水平在EMs 异位病灶中显著升高，升高的TNF-α 和趋化因子CCL2 可以通过辣椒素受体（TRPV1 受体）诱导感觉神经产生持续的动作电位，由此引发疼痛。而TNF-α 和趋化因子CCL2 亦能通过增强电流来调节电压门控性钠通道，从而导致超敏反应和痛觉过敏[27]。

近来发现巨噬细胞源性IGF-1 作为EMs 异位病灶神经生长和致敏的关键信号，在其耗尽之后可逆转EMs 小鼠的异常疼痛行为，并显著减少腹腔内的病变数量[28]。也有最新研究发现巨噬细胞中的P2X7、P2X4 与P2X3 受体可以通过ATP 激活免疫系统并导致细胞因子的产生，从而保持持续的炎症状态，而其中P2X4 受体的激活参与了由胞质磷脂酶A2 介导的环氧合酶（cyclooxygenase，COX）依赖性前列腺素E2 的释放，参与初级感觉神经元的致敏[29]；而异位灶中ATP 含量的升高则加速了IL-1β 的分泌，其通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（MAPK/ERK/CREB）信号通路促使P2X3 受体表达上调，从而促进感觉神经元的敏化并向中枢神经系统传递疼痛信息[30]。因此，巨噬细胞在神经纤维的形成及痛觉致敏性中均发挥了重要的作用。

3.2 EMs巨噬细胞对血管生成的促进作用 EMs的主要病变部位在盆腹腔，其发病机制与血液、腹腔及病灶中免疫微环境的改变密切相关。EMs 患者腹腔液及在位子宫内膜的巨噬细胞吞噬能力下降，NK细胞活性降低，使得逆流的内膜细胞逃脱了免疫清除，在盆腹腔种植、生长。同时，以巨噬细胞为主的免疫细胞分泌相应的炎性细胞因子形成炎性微环境，促进异位病灶神经纤维的形成以及血管内皮细胞增殖和微血管网络的形成，为EMs 的进一步发展提供神经及营养支持[31]。

研究发现，巨噬细胞是促进血管生成的重要因素，巨噬细胞既参与了脉管系统的最初建立，也参与了血管网的最终形成。其作用是通过以下途径介导的[32]：①巨噬细胞在缺氧环境下分泌部分具有生物活性的生长因子——基质金属蛋白酶家族，其与ECM 结合并激活VEGF 相关通路；②VEGF 家族成员的表达同时也招募了巨噬细胞在内的髓样细胞聚集，形成了促进分泌血管生成相关因子的正反馈。而关于巨噬细胞引导血管生成的具体机制尚不明晰。

近期有研究表明，CD206+样巨噬细胞可以通过上调TGF-β1 的表达从而增加异位内膜基质细胞中VEGF-A 的表达，进而诱导血管生成[33]。而巨噬细胞还可以分泌细胞因子IL-1β 等刺激异位病灶的基质细胞产生VEGF，从而促进血管生成。还有研究进一步发现，表达Tie2 的巨噬细胞迁移到新形成的异位病灶微血管周围的组织区域，通过抑制内皮细胞的凋亡来维持血管持续生存的能力[34]。还有学者发现VEGFR1+/CD11b+样巨噬细胞可以分泌碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）促进异位病灶血管生成，而FGF 受体激酶抑制剂PD173047 可显著抑制异位病灶生长和血管生成[35]。因此，VEGFR1 也有望成为EMs 的潜在治疗靶点。

4 结语与展望

EMs 是困扰女性的一种病因复杂的疾病，其发病机制尚不明晰。而在其疾病的进展过程中，巨噬细胞活化后分泌的细胞因子促进了异位病灶神经纤维的形成、血管网的建立，导致疼痛的产生和疼痛的敏化，并为异位病灶的生长提营养支持。同时，EMs 异位组织中的神经纤维也可释放促炎肽影响巨噬细胞功能。巨噬细胞与神经纤维及血管生成之间的交互作用促进了EMs 的发展。因此针对其交互关系，可以针对性研制靶向药物，如巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）可以抑制巨噬细胞聚集，抗血管生成剂卡麦角林可以减少巨噬细胞从而抑制神经血管的生成，甚至可以探索具有活血抗炎作用的中草药来针对性治疗，为EMs 的治疗提供新思路。