未折叠蛋白反应-内质网自噬在心血管疾病中的研究进展

强 郑，周心怡，吴晓媚，冯家成

（1.珠海市妇幼保健院病理科，广东珠海 519000；2.珠海市妇幼保健院检验科，广东珠海 519000）

提要：未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）是在病理因素刺激下，由于错误蛋白聚集在内质网诱导细胞核减少蛋白合成以缓解内质网压力的保护措施。内质网自噬是溶酶体特异性选择降解受损内质网的代谢过程。UPR 和内质网自噬的表达关系可以是协同，亦可是拮抗，更重要的是，将UPR-内质网自噬调节至正常水平范围内，这将更有利于心肌细胞生存。本文将概述未折叠蛋白反应-内质网自噬在心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）中的研究进展。

内质网是细胞内一个精细的膜系统，占细胞总膜面积的50%，其由一个连续的膜囊和膜管网组成，可包括粗面内质网和滑面内质网，它们均为内质网连续结构的一部分［1］。粗面内质网因表面附着有核糖体颗粒而得名，其主要与外输性蛋白的合成加工有关，多存在于具有分泌肽类激素的细胞中；滑面内质网表面无核糖体附着，其在不同细胞的不同时期的结构、数量、分布及功能特性都各不相同，例如在心肌细胞中特化的滑面内质网，称为肌质网，可储存及释放钙离子调节肌肉收缩［2］。因此，内质网的正常运行是保证细胞内蛋白、脂类等合成加工以及钙离子平衡等功能的重要前提，一旦内质网受到病理刺激，内质网形态及功能会发生紊乱，这称之为内质网应激［3］，它会诱发相应补救措施协助其缓解压力，补救措施主要包括三大类反应：（1）未折叠或错误折叠的蛋白在内质网蓄积引发的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）；（2）正确折叠的蛋白在内质网过度蓄积激活核因子Kappa B 引发的内质网超负荷反应；（3）胆固醇缺乏诱导释放固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白-固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatorv element bingding proteins，SREBP）复合物引发的胆固醇调节级联反应；其中，UPR 发挥着主导作用，其负责将内质网应激信号传递至细胞核，细胞核降低蛋白转录和翻译水平，以缓解内质网压力［4］。更重要的是，内质网应激信号在诱导UPR 的同时，也会激活自噬信号通路形成自噬小体包裹受损内质网，运送至溶酶体进行降解和再利用，以保证内质网的正常代谢，这种特异性的选择自噬过程被称为内质网自噬［5］。

1 未折叠蛋白反应-内质网自噬在心血管疾病中的作用机制

1.1 心肌梗死

Jiang 等［6］通过手术结扎C57BL/6 小鼠心脏冠状动脉左前降支，模拟建立急性心肌梗死动物模，检测发现实验组心肌组织中血小板-内皮细胞黏附分子、血管内皮细胞钙黏连蛋白的表达明显上调。此外，在急性心肌梗死后增生的血管中检测发现葡萄糖调节蛋白78（glucose regu⁃lated protein 78，GRP78）和微血管相关蛋白1 轻链3（mi⁃crotubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、BECLIN-1的表达明显上调。随后，为深入了解心肌梗死后血管生成机制，在人脐静脉血管内皮细胞中进行缺氧处理并过表达血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-a，VEGF-A），检测发现自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）4、ATG5、LC3、BECLIN-1 的表达明显上调，且需肌醇酶l（inositol-requiring kinase 1，IRE1）、GRP78 的表达明显上调，另外，利用自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）干预之后，检测发现IRE1、GRP78 的表达明显下调，而利用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸干预之后，检测发现LC3、BECLIN-1 的表达明显下调。由此可知，上调UPR-内质网自噬水平可以促进心肌梗死后血管的生成。

1.2 心肌缺血再灌注损伤

Chang 等［7］通过提取Sprague-Dawley 大鼠原代心肌细胞，并间断缺氧孵化器培养处理，模拟建立心肌细胞缺氧再灌注损伤模型，检测发现实验组中GRP78、C/EBP 的同源蛋白（CCAAT enhancer binding protein homologous protein，CHOP）的表达明显下调，而LC3 的表达明显上调，且免疫荧光检测发现自噬小体明显增加。此外，利用3-MA干预之后，检测发现GRP78、CHOP、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，EIF2α）、IRE1、活化转录因子（activat⁃ing transcription factor，ATF）4、ATF6 的表达明显上调。与此同时，将C57BL/6 小鼠饲养在间断缺氧培养箱中，模拟建立心肌缺血再灌注损伤模型，检测发现实验组中LC3 的表达明显上调，而其GRP78、CHOP 的表达明显下调。另外，在给实验组小鼠喂养3-MA 干预之后，检测发现其GRP78、CHOP 的表达明显上调。由此可知，在心肌缺血再灌注损伤时，可以适应性增加内质网自噬水平，进而减少UPR。

1.3 心力衰竭

Li 等［8］在Sprague-Dawley 大鼠皮下注射β1 肾上腺素受体抗原肽，模拟建立心力衰竭模型，检测发现LC3、BE⁃CLIN-1 的表达明显下调，而选择性自噬底物的表达明显上调，GRP78 的表达明显上调。与此同时，利用β1 肾上腺素受体抗体刺激H9c2 大鼠心肌细胞，检测发现其LC3 的表达明显下调，而GRP78、CHOP 的表达明显上调。另外，在实验组加入内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐干预之后，检测发现LC3、BECLIN-1 的表达明显上调，而P62 的表达明显下调。由此可知，在β1-AA 诱导的心力衰竭中，适应性上调UPR 抑制自噬过度清除受损内质网。

1.4 心肌肥大

Xie 等［9］通过培养H9c2 大鼠心肌细胞，利用人牛吡啶（APELIN-13）诱导心肌肥大模型，检测发现其GRP78、CHOP 和LC3、BECLIN-1 的表达明显上调，透视电镜下观察到受损内质网和自噬小体明显增多。此外，在实验组分别加入GRP78 和CHOP 抑制剂干预之后，检测发现大鼠LC3、BECLIN-1 的表达均明显下调，更重要的是，干预组大鼠中的心肌肥大标志物脑钠肽的表达明显下调。由此可知，在人牛吡啶诱导的心肌肥大中UPR-内质网自噬水平被过度激活，有效地减少UPR-内质网自噬将有利于人牛吡啶诱导的心肌肥大。

1.5 心律失常

Marit 等［10］通过培养HL-1 心房细胞，并利用频率刺激器模拟心房颤动频率，建立心房细胞心房颤模型，检测发现LC3、ATG12 的表达明显上调，而P62 的表达明显下调，且透视电镜下观察到自噬小体明显增多，随后，检测还发现实验组中EIF2α、ATF4、ATF6、CHOP 的表达明显上调，且透视电镜下观察到受损内质网明显增多。为深入研究UPR-内质网自噬在心房颤动中的作用机制，利用4-PBA干预实验组之后，检测发现LC3、ATG12 的表达明显下调，而P62 的表达明显上调。与此同时，在动物实验中，通过口服三磷酸腺苷溶液喂养狗建立心房颤动模型，检测发现LC3、ATG12 和ATF6、CHOP 的表达明显上调，另外，口服4-PBA 溶液干预之后，检测发现LC3、ATG12 的表达明显下调，而P62 表达明显上调，更重要的是，干预组心房动作电位持续时间明显缩短、L-型钙离子通道电流明显减少以及心房重构明显改善。由此可知，UPR-内质网自噬在心房颤动模型中被明显激活，有效地抑制UPR-内质网自噬将有助于心房重构。

1.6 肥胖型心肌病

Hsu 等［11］利用高脂饲养C57BL/6 小鼠，16 周后检测发现，实验组小鼠血脂、血糖均明显增高，并心肌损伤标志物肌钙蛋白的表达明显上调，此外，LC3 的表达明显上调，而蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like endo⁃plasmic reticulum kinase，PERK）的表达明显下调。由此可知，UPR-内质网自噬在高脂诱导的心肌损伤中发挥着重要作用，但其机制需要深入研究。

2 总结

UPR 是在病理因素刺激下，由于错误蛋白在内质网聚集诱导细胞核减少蛋白合成以缓解内质网压力的保护措施，其主要涉及3 条信号通路，分别与内质网跨膜蛋白PERK、IRE1 和ATF6 有关，在生理状态下GRP78 分别和PERK、IRE1、ATF6 形成稳定复合物［12］，而在应激状态下GRP78 分别和PERK、IRE1、ATF6 解离，形成PERK-eIF2α、IRE1-X-盒结合蛋白1（X box-binding protein 1，XBP1）和ATF6-ERSE 三条信号通路，其中，（1）PERK-eIF2α 信号通路能抑制翻译起始复合物中鸟嘌呤二核苷酸磷酸（GDP）与鸟嘌呤三核苷酸磷酸（GTP）的交换，阻断翻译起始复合物eIF2α-GTP-tRNAMet 的组装，减少蛋白的翻译与合成；（2）IRE1-XBP1 信号通路可以结合内质网应激反应元件的基因启动子，诱导CHOP、GRP78 等分子伴侣和蛋白降解酶的表达，加快蛋白折叠和错误蛋白降解；（3）ATF6-ERSE 信号通路可以诱导含有内质网应激反应元件的基因启动子起始转录［13］。最新研究发现，UPR 不仅仅在心血管疾病中发挥着重要的调控作用，在结肠炎、糖尿病肾病、脑缺血、骨肉瘤和肝癌等非心血管疾病中也起到至关重要的调节功能［14-18］。

自噬是一种高度保守的分解代谢过程，由溶酶体清除受损细胞器和错误蛋白，并将其产物循环利用来维持细胞内稳态，其在细胞器周转中起着关键作用，参与细胞的生长发育，维持细胞代谢平衡，是细胞生存必不可少的代谢过程。自噬分为3 种形式：微自噬、大自噬和分子伴侣介导的自噬，它们的细胞功能和靶点传递给溶酶体的方式各不相同［19］。目前，研究最多的形式是大自噬，其分为4 个步骤：（1）细胞接受自噬诱导信号；（2）脂质形成孤立自噬小体；（3）自噬小体延伸包裹目标内容物；（4）溶酶体识别并降解自噬小体［20］。以往研究认为，自噬是一个非特异性地降解受伤细胞器和错误蛋白的过程，但是，Bernales 等［21］研究发现，在衣霉素诱导酵母发生内质网应激时，电子显微镜下观察到双层膜结构小囊泡，该囊泡被证实为只含有内质网的自噬小体，因此，该囊泡形成和降解的过程被称为“内质网自噬”，更重要的是，这也证实内质网自噬是一个具有特异选择性的代谢过程，其主要的分子过程：（1）在应激状态下，通过mTOR 途径激活ULKATG13-FIP200-ATG101 复合物，诱导自噬起始；（2）内质网和DFCP1 形成欧米伽体，同时，ATG13 诱导ATG14-VPS34-BECLIN-1 复合体作为原料；（3）欧米伽体和ATG5-ATG12-ATG16L 复合物结合形成自噬小体；（4）自噬小体延伸包裹受损内质网，并和ATG5-ATG12-ATG16L 复合物解离；（5）溶酶体通过识别自噬小体膜上LC3 II，降解自噬小体［22］。

综上所述，UPR-内质网自噬在正常心肌细胞代谢中均发挥着重要的调节功能，同时，也是心肌细胞生存必不可少的代谢过程，在生理状态下，基础水平的UPR-内质网自噬可以被视为保护作用，它们分别通过减少错误蛋白合成和降解受损内质网来促进心肌细胞生存。值得一提的是，在应激状态下，不在基础水平范围内的UPR-内质网自噬又可被视为损害作用，其一，过度水平的UPR-内质网自噬可以导致心肌细胞的蛋白合成不足和细胞器过度降解，使得心肌细胞缺乏蛋白和细胞器［23-24］；其二，过低水平的UPR-内质网自噬可以导致错误蛋白聚集和受损内质网残留，使得心肌细胞的代谢失衡［25-26］。但是，通过以上研究结果，我们不难发现在心血管疾病中，UPR 和内质网自噬的表达并非一致，二者可以是协同关系，亦可是拮抗关系，因此，明确UPR 与内质网自噬的在心血管疾病中的表达关系是非常关键的，更重要的是，将UPR-内质网自噬调节至正常水平范围内，这将更有利于心肌细胞生存。但是，就目前的报道来说，有关UPR-内质网自噬在心血管疾病中的研究还是相对缺乏，个别心血管疾病甚至还没有相关研究报道，因此，探讨UPR-内质网自噬在心血管疾病中的作用机制也可以作为未来研究的方向之一。