白及多糖联合5-氟尿嘧啶对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

温艳，张强，曹涵博△

（1.陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710065；2.陕西省药品疫苗检查中心，陕西 西安 710065）

肝癌是我国较常见及高发肿瘤［1］。化学合成药物对其疗效良好，但不良反应较明显；传统中药因其疗效较好和不良反应较少的优点在治疗癌症方面具有一定优势［2］。白及为我国传统中药，是兰科植物白及的干燥块茎，药用历史悠久、价值高，有止血、收敛、生肌、消肿等功效，主要化学成分包括联苄类、菲类、二氢菲类、萜类化合物等［3］。白及多糖（BSP）为从中药白及中提取获得的甘葡聚糖，药理学研究结果表明具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用，在医药领域具有较高价值［4-5］。5-氟尿嘧啶（5-FU）是目前常用于胃癌、食管癌、肠癌等癌症的治疗［6］。细胞凋亡受多基因的严格控制，如B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族，半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族、原癌基因C-myc等［7］。有研究报道多糖对化学药物治疗（简称化疗）药物有增效作用［8］。本研究中选取合适质量浓度的BSP，联合5-FU作用于体外培养的肝癌细胞株，并对其进行活力检测，分析作用后凋亡相关蛋白基因及蛋白表达的变化，为BSP抗肝癌的作用机制提供实验证据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药及细胞

仪器：DNM-9606型酶联免疫检测仪（德国Thermo公司）；MA-6000型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Tanon 5200型化学发光仪（赛默飞世尔科技公司）；Attune Nxt型流式细胞仪（美国BD公司）；SHB-1600A2型生物安全柜（苏州净化设备仪器厂）。

试药：DMEM基础培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司，批号分别为AG29719232，AF29548181）；青霉素-链霉素（美国Gibco公司，批号为171334）；BSP（陕西师范大学生命科学学院实验室，以生理盐水溶解）；5-FU（美国MCE公司，批号为HY-90006）；CCK-8试剂（美国Sigma公司，批号为91963）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号为CA1050）；Caspase-8、B淋巴Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（BAX）、GAPDH、山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（英 国Abcam公司，批号分别为ab32397，ab32124，ab32503，ab8245，b205718，ab205719）。

细胞：人肝癌HepG2细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 方法

细胞活力：采用CCK-8法。取对数生长期的HepG2细胞，接种于96孔板，在37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，加入不同质量浓度（50，100，200，400，800μg/mL）的BSP，另设空白对照（等体积生理盐水）。每孔加入培养基100μL，每组设5个复孔，分别培养24，48，72 h后加入CCK-8试剂10μL，37℃反应30 min，以酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（OD）值。另设对照组（等体积生理盐水）、BSP组（400μg/mL）、5-FU组（0.02 mol/L）、BSP+5-FU组（400μg/mL+0.02 mol/L），培养细胞48 h，同法操作。

细胞凋亡：采用流式细胞术。取对数生长期的HepG2细胞，接种于24孔板，在37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，同“细胞活力”项分组，分别进行相应处理48 h，用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒严格按说明书进行染色，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表达：采用荧光定量聚合酶链式反应。将HepG2细胞接种于6孔板处理48 h，加入Trizol裂解液，再加入氯仿200μL，4℃下12 000g离心15 min，加入等体积异丙醇，4℃下12 000g离心10 min，按Takara反转录试剂盒说明书进行反转录和PCR扩增。PCR扩增条件：94℃，5 min；94℃40 s，56℃50 s，72℃10 min，45个循环；72℃10 min。在引物由上海金唯智公司合成，定量PCR结果通过2-ΔΔCt计算，以GAPDH为内参，各组设3个复孔。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表达：采用Western blot法。将细胞接种于100 mm细胞培养皿中，按“细胞凋亡”项下分组分别处理48 h，加入细胞裂解液，测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，洗脱，二抗室温孵育1 h，洗脱。用增强型化学发光试剂（ECL）显影，成像，目的条带与内参（GAPDH）条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.3 数据处理

采用GraphPad 6软件进行数据分析。数据均以X±s表示，行独立样本或配对样本t检验，以及单因素方差分析。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同质量浓度BSP对细胞活力的影响

结果见图1。处理细胞24 h后，质量浓度为800μg/mL的BSP对细胞活力有显著抑制作用（P＜0.05）；处理细胞48 h后，质量浓度为400μg/mL和800μg/mL的BSP对细胞活力有显著抑制作用（P＜0.01），400μg/mL时的抑制率约为20%；处理细胞72 h后，质量浓度分别为100，200，400，800μg/mL的BSP对细胞活力均有显著抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。综合考虑，选择BSP质量浓度为400μg/mL，细胞处理时间为48 h。

图1 BSP对HepG2细胞活力的影响Note：Compared with 0μg/mL，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.1 Effect of BSP on the viability of HepG2 cells

2.2 BSP+5-FU对细胞活力的影响

400μg/mL BSP和0.02 mol/L 5-FU对HepG2细胞活力的抑制率分别为23%及45%，联用后达56%，与两者单独作用比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。详见图2。

图2 不同药物对HepG2细胞活力的影响Note：Compared with those in the control group，△P＜0.01；Compared with those in the 5-FU group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the BSP group，aP＜0.05，aaP＜0.01（for Fig.2-5）.Fig.2 Effects of different drugs on the viability of HepG2 cells

2.3 细胞凋亡结果

BSP+5-FU组的细胞凋亡率为（47.46±5.15）%，显著高于BSP组的（17.10±1.45）%（P＜0.01）及5-FU组的（31.03±2.5）%（P＜0.01）。详见图3。

图3 不同药物对细胞凋亡的影响A1.Control group A2.5-FU group A3.BSP+5-FU group A4.BSP groupA.Flow cytometry B.Data statisticsFig.3 Effects of different drugs on the apoptosis of HepG2 cells

2.4 Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表达结果

与对照组比较，BSP+5-FU组Caspase-8，BAX mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），Bal-2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。与5-FU组和BSP组比较，BSP+5-FU组Caspase-8、BAX mRNA的表达水平显著升高（P＜0.01）；Bcl-2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。详见图4。

图4 BAX，Bcl-2，Caspase-8 mRNA表达水平A.BAX B.Bcl-2 C.Caspase-8Fig.4 Expression levels of BAX，BCl-2，Caspase-8 mRNA

2.5 Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表达结果

与对照组比较，BSP+5-FU组Caspase-8、BAX蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与5-FU组和BSP组比较，BSP+5-FU组Caspase-8，BAX蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；Bcl-2蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05）。详见图5。

图5 Bcl-2，Caspase-8，BAX蛋白表达水平B1.Caspase-8 B2.Bcl-2 B3.BAXA.Electrophoretogram B.Data statisticsFig.5 Expression levels of Bcl-2，Caspase-8，BAX protein

3 讨论

中医药可在缓解肝癌患者的临床症状、提高其生活质量和免疫功能、预防复发转移、延缓肿瘤进展、延长生存时间等方面发挥显著作用，其作用机制主要体现在诱导细胞凋亡、自噬、阻滞细胞周期、调节免疫功能、抑制转移和血管生成、逆转耐药、增强化学药物治疗（简称化疗）效果等方面［9-11］。20世纪70年代多糖就被发现参与调控细胞生命活动，并具有重要的生理活性［12］。白及可用于治疗消化道黏膜损伤、溃疡、出血、跌打损伤和烧伤。大量研究表明，BSP具有较强的抗肿瘤活性［13］，可增强血管内皮细胞的增殖和血管内皮生长因子的表达［14］。

本研究结果显示，BSP、5-FU单独作用时均可对HepG2细胞的活力产生抑制作用，两者联用产生的抑制作用较单用更明显，细胞出现明显的凋亡，Caspase-8、BAX mRNA表达水平显著升高，其蛋白表达水平亦显著升高，Bcl-2 mRNA水平和蛋白表达水平明显降低，这可能是BSP+5-FU对肝癌细胞促凋亡作用的重要机制之一，仍待进一步研究。GAO等［15］的研究表明，多糖与肿瘤细胞膜具有良好的生物相容性，可能有增加药物进入细胞的能力，这可能是BSP能大幅增加5-FU活性的原因之一。

综上所述，在体外条件下，BSP+5-FU可明显抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，其主要机制可能是通过对凋亡相关蛋白Caspase-8，Bcl-2，BAX等基因的调控发挥作用，BSP可能通过Caspase途径促进HepG2细胞的凋亡来发挥抗肿瘤作用，但仍需进一步研究。