分子标记在澳洲坚果遗传育种中的应用研究进展

李 冰，杨祥燕，蔡元保，曾黎明，林玉虹，李季东

（广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001）

澳洲坚果（Macadamiaspp.）属山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（MacadamiaF.Muell.）多年生常绿乔木果树，源自澳大利亚亚热带雨林气候地区。1843 年德国探险家Leichhardt 最先发现，命名为昆士兰坚果，1857 年正式命名为澳洲坚果，随之先后被引入世界各热带、亚热带地区。虽然20世纪70 年代我国才开始引种试种澳洲坚果，但目前我国澳洲坚果的种植面积居于世界首位，已在云南、广西、广东、海南和贵州等地区广泛种植。澳洲坚果果仁含油量高，多为单一不饱和脂肪酸，且富含蛋白质，具有较高的营养价值和药用价值，被誉为“坚果皇后”。澳洲坚果单产和总产量低，且产品在世界各地供不应求，因此，选育出高产优质的澳洲坚果品种以提高其产量，是目前澳洲坚果遗传育种工作的重中之重。

DNA 分子标记技术与传统育种技术相结合，可以极大的缩短育种年限，加快作物育种进程。目前分子标记技术已经在水稻[1]、苹果[2]、龙眼[3]、番木瓜[4]等作物中得到广泛的应用，在作物遗传育种改良中发挥重要的作用。随着生物技术的不断发展，RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA 标记）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）、SSR（Simple Sequence Repeats，简单重复序列标记）、SCoT（Start Codon Targeted Polymorphism，目标起始密码子多态性）等分子标记技术也逐渐应用于澳洲坚果遗传育种研究。本文主要综述了分子标记技术在澳洲坚果种质资源遗传多样性分析、DNA 分子指纹图谱构建和遗传图谱构建中的研究进展，并分析了其在澳洲坚果研究中的发展前景。

1 分子标记的类型及用途

分子标记是物种基因组中有其特有位置的DNA片段，是形态学标记、细胞学标记和生化标记之外的第四种遗传标记，其主要分为三大类：以分子杂交为基础的第一代分子标记（RFLP 等）、以PCR技术为核心的第二代分子标记（AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SCoT 等）以及以序列测序为基础的新一代分子标记SNP、InDel（Insertion Deletion Length Polymorphism，插入缺失长度多态性）、EST（Expressed Sequence Tag，表达序列标签）等。分子标记与其他三种遗传标记相比，具有许多优点，包括不受组织类别、发育阶段和生存环境的影响，标记数量分布于整个基因组且多为共显性标记，多态性高、能遗传稳定等，是一种相对理想的遗传标记类型。分子标记可应用于标记重要性状基因、构建遗传连锁图谱、分子标记辅助选择及分析种质遗传多样性等方面，并在植物遗传育种和基因组研究中发挥着重要作用。

2 分子标记在澳洲坚果中的研究进展

2.1 澳洲坚果种质资源的遗传多样性分析

澳洲坚果种质资源丰富，但是由于交叉引种、自然变异、杂交等因素，遗传背景复杂，亲缘关系比较杂乱。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础，种质遗传背景分析可为作物品种鉴定和品种纯度监测提供科学依据。利用DNA 分子标记开展澳洲坚果种质资源的遗传多样性等研究，可以有效地提高澳洲坚果育种效率，加速澳洲坚果育种进程。

Peace 等[5]利用分子标记技术，分析了80 多个来自澳大利亚，美国夏威夷、加州，南非，以色列等地收集的澳洲坚果品种，将其品种分为7 个基因库。其中基因库1 和2 包含几乎所有的夏威夷品种和一些以色列品种，基因库3 和4 主要包含澳大利亚品种，基因库5 和6 主要是澳大利亚杂交品种，基因库7 包含来自澳大利亚和南非的杂交种和粗壳种。而且，还分析了75 个澳洲坚果自然种群（共400 多份种质），并确定了光壳种、粗壳种和三叶澳洲坚果这3 个物种特有的分子标记（共120 多个），从DNA 分子水平上阐明了澳洲坚果品种资源的分类。此外，Peace 等[6]还利用RAF 标记辅助筛选出38 个南非澳洲坚果品种，并分析其品种间的遗传特性和亲缘关系，结果表明品种741u 即是741（Mauka），741s 则是800（Makai），791 可能是M.ternifolia第二代杂交种，Nelmak1 是M.inegrifolia和M.tetraphylla的第一代杂交种。这一结果为南非地区澳洲坚果种质资源的科学利用和产业可持续发展提供了重要依据。

Steiger 等[7]利用105 个AFLP 标记鉴定26 份澳洲坚果材料，明确分离出4 个澳洲坚果种，并对三叶澳洲坚果可能为全缘叶澳洲坚果变种这一观点提出质疑。在澳洲坚果属物种分类的主类群中，9 个已明确的光壳种品种被分为两个亚类群，这表明原始基因库的杂合性有助于澳洲坚果品种的改良。

唐莹莹等[8]利用单因素设计法，优化了澳洲坚果RAPD-PCR 反应体系，并通过不同引物和种质验证表明该反应体系可靠性、稳定性和分辨率较高，为澳洲坚果种质资源鉴定和遗传多样性分析提供了重要工具。Barbosa 等[9]利用RAPD 标记对澳洲坚果栽培种的不同无性系进行遗传特征分析。通过提取来自巴西和夏威夷的12 份澳洲坚果无性繁殖系叶片的DNA，并利用15 对RAPD 标记引物进行扩增，构建亲缘关系树状图。该结果表明，大多数遗传变异发生在群体内部并非群体之间，推测远缘群体可用于近亲繁殖或者杂交。

贺熙勇等[10]利用ISSR 分子标记技术，对收集到的64 个澳洲坚果种质进行分子聚类分析，将64 份种质分为5 类，但是其聚类结果与形态学分类的一致性相差较大，只有部分种质的亲缘关系和种类与已知的分类体系一致。郭凌飞等利用单因素设计法，建立与优化了澳洲坚果ISSR-PCR 反应体系[11]，并利用该分子标记分析17 份澳洲坚果品种的亲缘关系[12]。其UPGMA 法的聚类结果表明，17 个品种间遗传相似系数较大，可分为4 个类群，在最大的一个类群中包括所有夏威夷选育出的品种，而在澳大利亚选育出的品种则为独立的类群。因此，推测现育的夏威夷品种可能来源于2 个遗传多样性不同的群体；而澳大利亚现育品种的遗传背景和选育过程应该与夏威夷品种有所不同，其遗传关系可能更复杂。

谭秋锦等[13]对45 份澳洲坚果种质的单核苷酸多态性位点（SNPs）进行了基因分型、群体结构和UPGMA 聚类分析，将这45 份澳洲坚果种质分为4个类群，其中第1 类群有2 份种质，第2 类群有1份种质，第3 类群有4 份种质，第4 类群有38 份种质，其结果表明澳洲坚果种质资源存在很多品系。通过45 份澳洲坚果种质的亲缘关系与遗传多样性分析，可为SNP 标记在澳洲坚果辅助育种的应用提供科学依据。

SSR 分子标记重复性高，其实验结果稳定可靠，兼具PCR 反应的优点，广泛应用于作物遗传多样性分析、种质资源鉴定以及遗传育种工作中[14]。2006年，Schmidt 等[15]开发利用SSR 引物，分离出33个微卫星位点，为SSR 标记在澳洲坚果中的应用提供重要的位点标记。2013 年，李玉宏等[16]从100 对引物中筛选得到19 对SSR 引物，其中2 对可以应用于900×294 杂交组合的F1 代鉴定，为澳洲坚果分子标记辅助育种提供了理论依据。2019 年，唐莹莹等[17]利用单因素设计法，对SSR-PCR 的反应体系进行了优化，优化后的反应体系稳定可靠，对不同引物和澳洲坚果种质验证的分辨率更高，可适用于澳洲坚果SSR 分析，也为后续基于PCR 扩增反应的澳洲坚果相关试验提供一定理论和技术基础。2022 年，井敏敏等[18]利用9 对SSR 引物对91 份国外引进以及自主选育澳洲坚果品种进行遗传多样性分析，结果表明供试澳洲坚果具有较高的多态性。其UPGMA 聚类分析将91 份澳洲坚果材料分为2大类，亲缘关系与地理来源关系无明显相关性；AMOVA 分析结果表明澳洲坚果群体内遗传变异显著高于群体间变异。这些研究结果可为澳洲坚果种质资源的创新与利用提供杂交亲本的遗传背景。

2022 年，Ranketse[19]等利用13 个nSSRs（Nuclear microsatellite markers，核微卫星标记）对南非栽培澳洲坚果种质的遗传多样性和结构进行了研究，对来自夏威夷农业实验站31 份、澳大利亚19份、加州2 份、以色列1 份、南非31 份、两家当地农户的26 份供试材料进行了比较。研究结果为南非所选澳洲坚果材料含有丰富的杂种基因型，夏威夷和澳大利亚的供试材料大多含有M.integrifolia或者混合基因。这一结果为南非澳洲坚果基因育种改良提供了依据。

2.2 澳洲坚果DNA 分子指纹图谱的构建

以DNA 分子标记为基础的DNA 指纹鉴定技术在品种鉴定和纯度监测等方面具有高效的准确性。利用DNA 分子标记技术获得品种的DNA 分子指纹图谱，可用于鉴定品种的真实性与纯度，新品种登记、注册与知识产权保护等。

Steiger 等[7]利用105 个AFLP 标记鉴定26 份澳洲坚果材料，分离出了四个澳洲坚果种，且每个坚果种都显示出不同的AFLP 指纹图谱，表明这些种质中含有大量的遗传变异。蔡元保等[20]利用单因素设计法建立了澳洲坚果SCoT 最适反应体系，通过3 对SCoT 引物可将供试材料完全区分，并构建了12 份澳洲坚果种质材料的指纹图谱，置信概率到达99.99%，为澳洲坚果种质（品种）鉴定和遗传多样性分析等提供技术支持，也为澳洲坚果品种的登记注册和产权保护提供了一种有效的技术手段。刘小翠等[21]利用SRAP 分子标记对45 份澳洲坚果材料进行基因组扩增和遗传多样性分析，将45 份澳洲坚果种质资源分为6 个种群；并构建DNA 指纹图谱，有效的鉴定了澳洲坚果种质资源间的遗传关系，为澳洲坚果种质资源利用和种质鉴定提供科学依据。李志强等[22]以4 份差异较大的种质为材料，从240对SSR 引物中最终选择22 对扩增稳定、多态性高的SSR 引物进行荧光标记。利用筛选出的22 对多态性引物对83 份澳洲坚果种质资源进行荧光检测，获得了83 份澳洲坚果基因组数据，并利用其中9 对荧光引物组合，构建该种质的SSR 指纹图谱，为澳洲坚果种质资源的鉴定工作提供了指纹数据信息。

2.3 澳洲坚果遗传连锁图谱的构建

遗传连锁图谱是在染色体重组的基础上，用遗传标记为路标，以两位点间的重组值作为遗传标记间的距离构建的图谱。构建遗传连锁图谱是识别与控制性状表达的基因相关标记的第一步，在阐明数量性状方面起着重要作用[23]。高密度遗传图谱的构建对于分子标记辅助育种和基因图位克隆在农作物发展应用起了重大推动作用。Peace 等[24]以Keauhou 和A16 的56 个F1 代为供试材料，通过RAF、RAPD、SSR 三种分子标记，分析出382 个标记，绘制了第一张澳洲坚果遗传图谱，为澳洲坚果遗传育种方面的QTL 定位和分子标记辅助育种打下坚实的基础。

Langdon[25]等利用澳洲坚果品种741 自交和双亲杂交（‘741’ × ‘A4’，‘741’ × ‘268’，‘A4’ × ‘268’）等组合建立了四个定位群体，总共构建了9 个遗传连锁图谱。其中741 自交图谱完全由共显性SNP 标记构建，而亲本杂交图谱同时包含了SNP 和PAV 标记。每个图谱由14 个连锁群组成，与澳洲坚果单倍体染色体数目一致。这些遗传连锁图谱被成功地用于澳洲坚果基因组支架的锚定和定位以及第一个假染色体尺度组装的构建，增强了对澳洲坚果遗传背景和基因组的了解，为未来澳洲坚果育种提供了重要工具。

3 分子标记在澳洲坚果研究中的应用前景

培育出稳定遗传、高产优质的澳洲坚果品种是目前澳洲坚果产业急需解决的问题。杂交育种是澳洲坚果新品种选育的常用方法，杂交种与亲本相比也具有更高的生产潜力。已有研究表明SSR 分子标记可被用于鉴定澳洲坚果杂交种[16，26]。通过连锁分子标记进行基因型和表型筛选，实现将多种优质高产基因聚合到同一澳洲坚果品种中，形成形状优良的聚合品种，是未来澳洲坚果分子标记育种的重要方向。近年来，澳洲坚果主产区十分重视澳洲坚果品种鉴定和分子遗传多样性分析，并取得了一些重要进展。这为世界澳洲坚果种质资源遗传多样性评价、种质创新与利用、分子标记辅助育种和新品种培育方面奠定了基础。随着澳洲坚果重要农艺性状的优异基因挖掘与功能验证[27-29]，其连锁的分子标记也将深入开发，从而使分子标记辅助育种技术在澳洲坚果遗传育种中的应用更加精准高效。尤其是随着澳洲坚果叶绿体基因组的公开及其基因组序列特性的分析[30]，基于叶绿体基因组的cpSSR 标记也将逐步应用到澳洲坚果种质资源和杂交品种的遗传特性分析。

利用分子标记分析澳洲坚果种质（品种）的遗传多样性，明确其分子遗传背景及其亲缘关系，可以对澳洲坚果种质资源进行创新与利用，有利于对澳洲坚果种质资源的保护。目前，澳洲坚果品种选育还是多选取传统育种方法，难以实现对目标性状快速高效的改良选育。转基因技术、分子标记技术等分子育种技术具有周期短、效率高、定向育种精确度高等优点，将这些现代分子生物学技术应用于遗传育种以提高果实的产量与品质，是澳洲坚果遗传改良的最重要育种目标。但与水稻、玉米、棉花等大田作物相比，澳洲坚果分子育种技术的研究和应用较为滞后，加强分子生物学技术在果树育种领域的研究应用将是未来育种的重要方向。但是，分子标记在澳洲坚果应用研究中存在技术含量不高和未能有效利用的问题，导致通过该技术获得的澳洲坚果新品种并不多。因此，开发出更多更有效的分子标记，并将分子标记育种技术与常规育种技术有效结合起来，将会有效提高澳洲坚果育种效率，选育出更多优良品种。