青稞对60Co-γ 射线照射小鼠造血功能的保护作用

赵亮星，赵卿宇，吴 彤，王 晗，薛 勇，沈 群

（中国农业大学食品科学与营养工程学院 国家粮食产业（青稞深加工）技术创新中心 北京 100083）

电离辐射是指可以直接或间接地引起物质原子和分子发生电离的辐射，主要包括带电粒子的辐射和电磁波辐射，前者包括由正电子或负电子组成的β 射线和由氦核组成的α 射线，后者包括γ 射线、X 射线和中子射线[1-2]。生活在地球上的人类每时每刻都受到各种辐射的影响。根据人类生存环境中电离辐射的来源，可将辐射分为天然辐射和人工辐射源辐射。天然辐射是指来自人类生存的自然环境的电离辐射，如来自地面的放射以及来自外层空间的宇宙射线（0.20～1.24 mSv），世界人均天然辐射剂量约为2.4 mSv/年，我国人均辐射剂量约为2.3 mSv/年[3]；人工辐射，如核工业工人受到的辐射剂量约1.5～2.75 mSv[4]，医疗领域的医用加速器的辐射剂量约2 mSv/次。1990 年国际放射防护委员会（ICRP）60 号建议书规定：职业性与个人照射在任何一年内的有效剂量不得超过50 mSv[5]。胡国辉等[3]认为1～10 mSv/年是公众可以接受的辐射剂量的安全阈值区。另一方面，由于人体各组织对辐射的敏感程度不一样，辐射剂量（Sv）=吸收剂量（Gy）×Q（生物组织加权系数）。值得注意的是，放射治疗（1～60 Gy）在治疗疾病的同时也会损害机体的正常细胞、组织与功能，当人类的全身吸收剂量达到2～7.5 Gy（啮齿动物3～10 Gy）时会发生造血功能障碍，是导致辐射死亡的主要原因[6]。同时，辐射会对机体免疫系统造成损伤，出现免疫力低下等情况，且免疫功能对造血功能的恢复有重要作用[7]，促使照射后免疫功能的重建以及造血功能的恢复[8]。

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.F.），又称裸大麦、米大麦、元麦，是禾本科大麦属一年生草本植物[9]，主要种植于西藏、青海以及四川、云南等地的高海拔地区，最高种植海拔可达4 500 m，是藏区的主要经济作物。青稞富含多糖、多酚、生育酚和活性肽等生物活性物质[10-11]，具有提高免疫力[12]，调节体重[13]，抗菌[14]，抗氧化[15]，调节肠道健康[16]，抗肿瘤[17]等作用。有研究表明，青稞多糖可通过促进脾细胞DNA 和蛋白质合成，发挥对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用[12]。青稞中含有的β-葡聚糖常用作生物应答调节剂，可调节宿主免疫反应，增加辐射损伤小鼠内源多效造血干细胞的数量，发挥造血功能的保护作用[18]。然而，青稞是否对辐射损伤小鼠的造血功能有保护作用尚不明晰。

本研究以20%青稞饲料喂养4 周龄C57BL/6J 小鼠12 周后，通过4 Gy60Co-γ 射线照射小鼠，并继续喂养2 周后观察青稞对小鼠生长发育、骨髓有核细胞数及外周血象指标等指标的影响，探讨青稞对60Co-γ 射线照射小鼠造血功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

SPF 级雌性4 周龄C57BL/6J 小鼠24 只，体重16～18 g，由维通利华提供。动物许可证编号：SCXK（京）2016-0006。

“藏青3 号”青稞粉，由山西东方亮生命科技股份有限公司提供。AIN-93G 基础饲料，购于常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

PBS 缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；伊红，美国Sigma 试剂公司；乙酸，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 仪器及设备

3100 型自动血生化分析仪，日本日立公司；Eclipse E100 型显微镜，日本Nikon 公司；60Co-γ射线辐照源，北京大学化学学院；EG1150H 型分体式石蜡包埋机，德国Leica 公司；Centrifuge 5430R 型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；BC-5000Vet 型兽用全自动血液细胞分析仪，深圳迈瑞生物医疗股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞基本营养成分的测定及青稞饲料的制作 青稞中的蛋白质根据GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的方法测定，脂肪根据GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的方法测定，膳食纤维根据GB 5009.88-2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》 中的方法测定，粗多糖根据SN/T 4260-2015 《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》 中的方法测定，β-葡聚糖根据NY/T 2006-2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》 中的方法测定，总多酚根据T/AHFIA 005-2018 《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定 分光光度法》 中的方法测定，灰分根据GB 5009.4-2016 《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中的方法测定，水分根据GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》 中的方法测定。

正常对照组（NCD）饲料和青稞干预组（WGB）饲料的主要营养素和热量需保持一致，添加20%青稞粉后，相应减少纯化饲料中玉米淀粉、酪蛋白、麦芽糊精、大豆油、蔗糖的含量，饲料配方和供能比例见表1。WGB 组饲料由常州鼠一鼠二生物科技有限公司代为配比加工。

表1 饲料配方Table 1 Feed formula

1.3.2 动物实验设计及分组 小鼠饲养于北京大学医学部SPF 级动物房，饲养条件严格按照《实验动物管理条件》进行，实验方案得到中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会的批准，批准编号为：AW71302202-5-2。小鼠适应性饲养1 周后，随机分成3 组，每组8 只（n=8）。正常对照组（NCD 组；未经过辐射暴露）与辐射对照组（IRC 组；经辐射暴露）均采用基础饲料喂养，青稞干预组（BWG 组；经辐射暴露）采用含20%青稞的饲料喂养。饲养期间（12 周）小鼠自由进食和饮水，每周称重、记录摄食量。12 周后，除NCD 组之外，IRC 组和BWG 组小鼠进行一次性全身辐照4 Gy 剂量的60Co-γ 射线照射。照射后继续喂养14 d，并于辐照后第14 天眼眶取血后颈椎脱臼处死小鼠，收集小鼠肝脏、脾脏、胸腺等组织进行后续分析检测。

1.3.3 实验动物造模 除正常对照组小鼠外，其余所有小鼠分别置于单独的有机玻璃（3 cm×3 cm×11 cm）中，一次性全身辐照4 Gy 剂量的60Coγ 射线，吸收剂量率为1 Gy/min，辐照时间为4 min。

1.3.4 骨髓有核细胞计数 参照赵钕君[19]的方法进行骨髓有核细胞计数。

1.3.5 外周血象的检测 分别于辐射前1 天，照射后第1，7 天和14 天尾静脉取血20 μL，用兽用全自动血液细胞分析仪分析白细胞、红细胞、淋巴细胞和血红蛋白变化水平。

1.3.6 免疫脏器指数测定 辐照后第14 天，取出各组织器官，称重，计算脏器指数。

脏器指数=脏器质量（mg）/体重（g）。

1.3.7 骨髓和脾脏病理检测 辐照后第14 天，参照冉媛媛[2]的方法进行骨髓和脾脏病理检测。

1.3.8 血生化指标的检测 辐照后第14 天后，将从眼眶采集的小鼠血液离心（3 000 r/min、15 min、4 ℃），获得的上清液即为血清，使用自动血生化分析仪测定血清中的总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

1.4 数据统计与分析

2 结果与讨论

2.1 青稞基本营养成分

青稞基本营养成分如表2 所示。

表2 青稞粉的基本营养成分（g/100 g）Table 2 Basic nutrients of Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.F.powder（g/100 g）

2.2 青稞对辐照小鼠基本指标的影响

2.2.1 青稞对辐照小鼠体重及进食量的影响 如图1a 所示，在未经过60Co-γ 射线照射的分组饲养期间，各组小鼠体重自然增加且无显著性差异。60Co-γ 射线照射后，小鼠体重呈现先下降后上升的趋势，其中IRC 组小鼠体重下降最为显著，且后期体重恢复较慢。辐照后1 天，与NCD 组相比，IRC 组与BWG 组小鼠体重均显著性降低；辐照后4 天，BWG 组小鼠体重明显增长，与NCD 组相比无显著差异（图1b）。在未经过60Co-γ 射线照射的分组饲养期间，各组小鼠摄食量无显著差异（图1c）。辐照1 周后，与NCD 组相比，经辐照后小鼠进食量虽显著降低，但BWG 组小鼠进食量显著高于IRC 组；辐照2 周后，各组进食量无显著差异（图1d）。图1 说明60Co-γ 射线照射在一定程度上影响小鼠正常的饮食，从而导致一定时间内小鼠体重呈下降状态，青稞干预能较快的恢复小鼠进食量，并使体重恢复至正常。

图1 饲养期间青稞对小鼠体重和摄食量的影响Fig.1 The effects of highland barley on the body weight and food intake of mice during rearing

2.2.2 青稞对辐照小鼠血生化指标的影响 血生化指标的稳态也是观测机体抗辐射损伤的重要指标，可以在一定程度上反映机体受辐照损伤的恢复程度[20]。如图2 所示，辐照2 周后IRC 组小鼠的血清TC 水平显著低于NCD 组小鼠，而BWG 组与NCD 组相比无显著差异。尽管各组血清HDLC、LDL-C、TG 水平无显著差异，但BWG 组各项指标更接近NCD 组。

图2 青稞对小鼠血生化指标的影响Fig.2 The effects of highland barley on blood biochemistry index of mice

Liu 等[21]以350 mg/kg β-D-葡聚糖灌胃6 Gy碳离子辐照小鼠，结果发现其可缓解由辐射引起的体重下降。本研究中的青稞含有2.13 g/100 g β-葡聚糖（表2），小鼠平均每日摄入含有20%青稞的饲料2.8 g，相当于每日平均摄入约477 mg/kg β-葡聚糖。由此可以推测青稞中的β-葡聚糖可能具有一定的改善辐射副作用的能力。

2.3 青稞对造血功能的影响

2.3.1 青稞对造血及血细胞的影响 造血系统主要由造血细胞与造血器官组成，骨髓产生的造血干细胞先分化形成各系定向祖细胞，后发育为各系幼稚细胞，进一步分化、成熟为红细胞、血红蛋白以及白细胞等各类血细胞[7，22]。骨髓有核细胞数是指骨髓细胞中含有细胞核的细胞数量，体现机体造血功能状态[19]。如图3 所示，小鼠经60Co-γ 射线照射后，小鼠骨髓有核细胞数均有不同程度地减少。与IRC 组相比，BWG 组小鼠骨髓有核细胞数恢复显著，与NCD 组无显著差异。

图3 青稞对小鼠骨髓细胞数的影响Fig.3 The effects of highland barley on the number of nucleated cells in the bone marrow of mice

如图4 所示，辐射后各组红细胞数量快速下降，在辐射后第7 天下降到最低点，随后逐渐上升；BWG 组红细胞数量上升速度明显高于IRC 组（图4a）。血红蛋白含量也呈现同样的趋势（图4b）。对于白细胞数量而言，辐射后各组白细胞数量急剧减少，辐射后第1 天即到达最低点，之后缓慢上升，第14 天时BWG 组白细胞数量显著高于IRC 组（图4c）。小鼠淋巴细胞也呈现出与白细胞数量同样的变化趋势（图4d）。

图4 青稞对小鼠外周血象的影响Fig.4 The effects of highland barley on the peripheral blood of mice

红细胞的功能是运输氧、电解质以及葡萄糖和氨基酸等新陈代谢所必须的营养物质，同时具有增强吞噬作用，提高防御能力，防止感染等作用[23]。白细胞的主要功能是防卫作用，不同种类的白细胞以不同的方式参与机体的防御反应。淋巴细胞是白细胞的一种，是体积最小的白细胞，主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者[24]。本研究表明青稞干预可以在一定时间内显著促进辐射小鼠红细胞、血红蛋白、白细胞及淋巴细胞水平的恢复，有助于小鼠免疫功能的恢复从而保全造血功能。

2.3.2 青稞对骨髓病理组织形态学的影响 如图5 所示，正常对照组小鼠的骨髓结构完好，骨髓内由红系细胞及髓系细胞细胞填充，并可见分布的巨核细胞。经60Co-γ 射线照射后，IRC 组小鼠胸骨骨髓出现明显的造血细胞坏死，脂肪组织增生，红系、髓系及巨核细胞数量明显减少，BWG 组小鼠脂肪组织增生明显少于IRC 组，造血细胞比例、形态和数量与NCD 组基本一致。同时，骨髓是白细胞发育、分化及执行功能的场所[24]。图5 结果表明青稞干预可以保护骨髓结构以明显恢复白细胞数量发挥免疫功能，从而发挥保全机体造血功能的作用，与图4 结果一致。

图5 青稞对小鼠骨髓病理组织形态学的影响Fig.5 The effects of highland barley on the histomorphology of bone marrow in mice

一些植物多糖具有增加小鼠骨髓有核细胞数量的功效。例如青稞中提取纯化的一种水溶性多糖能显著增加小鼠骨髓有核细胞数量[25]；当归多糖可调节细胞周期调控基因的表达，以延缓X 射线诱导的小鼠造血干细胞的衰老[26]，分别以50，100，200 mg/kg 灵芝多糖灌胃经5.0 Gy 剂量X 射线辐照小鼠，能有效减轻电离辐射引起血细胞的损伤程度，且具有剂量效应关系[27]；采用350，875 mg/kg 及1 750 mg/kg 酵母β-葡聚糖灌胃2 Gy 剂量碳离子束照射小鼠，发现β-葡聚糖能有效恢复辐照小鼠外周血细胞的水平，并显著增加辐照小鼠的骨髓有核细胞数，从而发挥对造血功能的保护作用[28]。本研究中采用的青稞饲料中含有9.74 g/100 g 粗多糖（表2），相当于每日平均摄入约2 181 mg/kg 多糖。由此可以推测青稞中的多糖尤其β-葡聚糖可通过保护骨髓组织和促进骨髓细胞增殖，发挥对辐照损伤小鼠的骨髓造血器官的保护作用，促进造血细胞的恢复，保护辐照小鼠的造血功能。

2.4 青稞对辐照小鼠免疫系统的影响

2.4.1 青稞对辐照小鼠脏器指数的影响 脏器指数可以在一定程度上反映器官功能的强、弱，肝脏、胸腺与脾脏是机体重要的免疫器官，同时与机体造血功能紧密相关[29-30]。如图6 所示，IRC 组小鼠肝脏脏器指数显著高于NCD 组，脾脏脏器指数显著低于NCD 组小鼠。BWG 组小鼠恢复肝脏及脾脏脏器指数的能力明显优于IRC 组。表明青稞干预可以显著促进辐照小鼠脏器指数的恢复。

图6 青稞对小鼠脏器指数的影响Fig.6 The effects of highland barley on the organ index of mice

2.4.2 青稞对脾脏病理组织形态学的影响 脾脏属于周围免疫器官，参与免疫细胞的成熟和分化，是免疫防御的重要场所[31]。如图7 所示，正常组小鼠脾脏白、红髓分界清晰，淋巴细胞分化完好，嗜碱性强。IRC 组小鼠脾脏白、红髓分界不清，白髓结构基本不可见，淋巴细胞减少。BWG 组小鼠脾脏白髓结构恢复，白髓淋巴细胞数显著增加，与2.2.1 节青稞有助于恢复辐照小鼠血细胞的结论相一致。印证青稞的预防性干预是通过防止辐照小鼠免疫功能损伤保全造血功能。

图7 青稞全谷对小鼠脾脏病理组织形态学的影响Fig.7 The effects of highland barley on the histomorphology of mouse spleen

有研究表明，植物中的多糖、多酚具有提高免疫力的作用。如青稞多糖能显著提高免疫抑制小鼠的脾脏和胸腺重量指数，从而改善免疫抑制小鼠的免疫功能[25]。安尚泽[32]指出，出芽短硬霉（A.Pullulans）菌株产生的细胞外分泌型β-葡聚糖可以提高小鼠免疫器官中胸腺和脾脏指数、血清和肝脏溶菌酶的活性、巨噬细胞的吞噬能力，减轻辐射对白细胞和淋巴细胞的杀伤，能促进白细胞和淋巴细胞再生[33]，促进IL-1、IL-6、TNF-α 的合成和释放，活化T 淋巴细胞[34]，从而发挥提升免疫功能的功效。以50，100，200 mg/kg 狗枣猕猴桃多酚对6 Gy 剂量60Co-γ 射线照射小鼠进行灌胃，发现多酚提高了辐射小鼠的脏器指数、机体的免疫力，保护小鼠的造血系统[35]。本研究采用的青稞含有0.33 g/100 g 多酚（表2），相当于每日平均摄入74 mg/kg 多酚。推测青稞中含有的多糖尤其β-葡聚糖与多酚可能通过保护免疫器官功能损伤，促进免疫细胞恢复，使机体免疫功能得到保全，从而防止机体造血功能的损伤。

3 结论与展望

青稞的预防性干预对辐照损伤小鼠的体重、辐照后进食量的影响较小，其可通过恢复免疫功能、血细胞水平、脏器指数与脾脏结构来减少辐照引起的机体免疫功能的损伤，通过明显恢复骨髓有核细胞数、外周血细胞数，减轻骨髓结构损伤，从而减少辐照引起的机体造血功能损伤。青稞属于日常性饮食谷物，本研究对青稞应用于辐射损伤的预防和辐射损伤后的恢复具有很强的现实意义。然而，本研究只探究了青稞干预对辐照小鼠造血系统的影响，研究仍然不够深入，有待于进一步开展更多的基础研究阐明机理。