肿瘤骨转移前微环境形成机制研究进展

唐亮 康辉 吕成伟 郭振海

(1 联勤保障部队第989医院骨科,河南 洛阳 471100； 2 河南科技大学第一附属医院骨科)

肿瘤转移前的微环境是指继发转移部位的组织或器官提前发生的局部细胞与分子的改变，为循环肿瘤细胞(CTCs)定植提供了环境支持，促进了肿瘤转移的发生。肿瘤患者的病死率与肿瘤转移密切相关，骨骼为较常见的肿瘤转移部位。肿瘤骨转移后会出现病理性骨折、中枢及周围神经压迫等一系列严重并发症。在CTCs进入转移部位时，局部的微环境决定了肿瘤细胞转移的进程。因此，转移前微环境的建立，是启动肿瘤转移的重要机制。

1 肿瘤微环境中原发肿瘤来源成分

原发肿瘤分泌的可溶性分子是肿瘤转移前微环境中的重要组成部分，主要包括肿瘤源性分泌因子(TDSFs)、细胞外囊泡(EVs)、细胞因子以及趋化因子等。

1.1 TDSFs

TDSFs可通过动员和招募骨髓细胞，促进转移前微环境形成。如缺氧诱导因子1(HIF-1)通过激活乳腺癌细胞的碳酸酐酶Ⅸ-NF-κB-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)通路，增加G-CSF的产生，从而动员骨髓来源抑制性细胞(MDSCs)，促进MDSCs到达转移部位而形成转移前微环境[1]。TDSFs不仅可以动员和招募骨髓来源的细胞(BMDCs)，还可促使BMDSs定植于肿瘤继发转移的组织或器官。

1.2 EVs

根据EVs直径大小可分为3类：直径≥30 nm而<100 nm被称为外泌体，直径≥100 nm而<1 000 nm的被称为微囊泡，直径1～10 μm的被称为癌小体[2]。外泌体包含有蛋白、mRNA、miRNA及DNA的片段，通过调节肿瘤细胞与周围组织的相互作用，促进转移前微环境的形成。原发肿瘤来源的外泌体所表达的整合素，可通过与相关细胞融合，激活Src蛋白磷酸化及增加促炎性因子S100的表达，而促进肿瘤转移前微环境的形成[3]。前列腺癌的骨转移率比较高，其来源的外泌体包含有多种microRNA(miR100-5p、miR21-5p、miR139-5p)，这些microRNA协同性地促进转移前微环境的形成[4]。外泌体中含有的DNA片段，还可有助于判断原发肿瘤的突变程度，在临床上可作为诊断和判断预后的生物标记物[5]。原发肿瘤来源的微囊泡能通过对肿瘤细胞与机体之间进行调节而促进转移前微环境的形成，微囊泡中的骨调素(OPN)可以动员BMDSs，还可以促进肿瘤细胞的定植；另外该微囊泡还能通过磷酸化内皮细胞的丝氨酸/苏氨酸，进而促进新生血管在微环境中的生成，不仅促进了肿瘤细胞的侵袭，同时也对化疗药物具有一定的抵抗作用[6]。癌小体包含有金属蛋白酶、RNA、微囊蛋白等成分，其中微囊蛋白可以促使前列腺癌细胞向癌症相关成纤维细胞(CAFs)内转运miR-1227，促进CAFs向转移部位迁移而逐步形成转移前微环境。因此，有转移倾向的肿瘤细胞可通过癌小体改造继发转移组织或器官的微环境，从而促进肿瘤的转移[7]。

1.3 细胞因子与趋化因子

肿瘤细胞产生的细胞因子，在转移前微环境的形成中也起着重要作用。如趋化因子CCL2可以招募肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)以及调节性T细胞(Treg)在转移部位形成与免疫相关的转移前微环境[8]。在乳腺癌发生骨转移的过程中，乳腺癌细胞释放的核苷酸(ATP/UTP)，可通过调节赖氨酰氧化酶以及单核细胞的招募，进一步激活嘌呤受体(P2Y2)而促进转移前微环境的形成[9]。

2 肿瘤动员的骨髓细胞

在转移前微环境的建立中，肿瘤动员的骨髓细胞发挥了重要作用。其可通过分泌炎性因子、生长因子以及促血管生成因子等成分，促进肿瘤细胞的定植、增殖以及转移[10]。如肿瘤细胞分泌产生的血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PIGF)，可动员和招募骨髓中表达VEGF受体1(VEGFR-1)的造血前体细胞，到达继发转移的组织或器官，从而形成转移前微环境[11]。肿瘤细胞产生的趋化因子以及细胞因子，可以动员MDSCs、TAMs、Treg以及肿瘤相关的中性粒细胞等骨髓细胞，进入继发的组织或器官，而形成转移前微环境[12]。由TAMs分泌的趋化因子CCL22以及由调节性B淋巴细胞(Breg)分泌的TGF-β，可以招募Treg至转移前微环境[13]。在乳腺癌发生骨转移的机制中，通过趋化因子CXCL12/CXCR4通路调控了Treg的聚集和增殖[14]。相关研究还表明，由IL-1β诱导T细胞产生的IL-17和中性粒细胞共同形成的微环境，也是促进乳腺癌发生骨转移的机制之一[15]。

3 骨基质微环境

骨基质微环境主要包括成纤维细胞、内皮细胞和血管等成分，在组织间连接和维持机体稳态方面起着重要作用。肿瘤细胞可以通过改造骨基质，建立有利于其定植并形成转移灶的微环境。成纤维细胞在转移前微环境中可以产生炎性因子和生长因子，招募和促进肿瘤细胞的定植，如基质细胞衍生因子1(SDF1)、TGF-β、钙结合蛋白A4(S100A4)、基质金属蛋白酶(MMPs)以及纤维连接蛋白[16]。内皮细胞则产生了促炎因子S100A8和S100A9，其可招募Mac-1+的髓样细胞到达转移前微环境[17]。在肿瘤骨转移过程中，动员和招募的破骨细胞起着重要作用，肿瘤分泌的可溶性细胞内黏附分子1(slCAM1)，可促进破骨细胞mircoRNA(miR-16、miR-378)的产生和破骨细胞的生成[18]。细胞外基质的改造与重塑中产生的纤维连接蛋白、MMP、骨膜蛋白等成分，也对肿瘤转移前微环境的形成起着重要作用[19]。

4 转移前微环境的形成过程

转移前微环境形成的具体过程包括免疫抑制过程、炎性反应阶段、血管形成以及通透性增加、淋巴管的形成、器官倾向性的产生等。

4.1 免疫抑制过程

机体内的免疫细胞，如CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞等，具有杀伤肿瘤细胞及抑制肿瘤转移的功能[20]。肿瘤细胞为躲避免疫系统的攻击，建立了能抑制免疫清除的微环境。如MDSCs、TAMs、Treg等细胞，均在转移前微环境中发挥免疫调节和免疫抑制作用[21]。MDSCs聚集在转移前微环境中通过精氨酸酶1(ARG1)和活性氧(ROS)发挥抑制T细胞的作用，另外在原发肿瘤细胞诱导的Breg促进作用下，MDSCs还可以产生更多的ROS以及一氧化氮，进一步发挥免疫抑制作用[22]。在发生骨转移的肿瘤中，可以观察到骨髓中聚集有大量的Treg，抑制免疫系统，进一步促进肿瘤骨转移[23]。因此，肿瘤转移前微环境中，免疫抑制过程主要是通过调节免疫细胞，尤其是抑制杀伤性T细胞对肿瘤的消灭作用，而起到促进肿瘤向骨组织转移的作用。

4.2 炎症反应

慢性炎症是肿瘤发展以及转移的一个重要因素，许多分子成分和信号通路参与其中，如异常激活Toll样受体4(TLR4)以及其他在免疫细胞上固有的感受器，均对肿瘤的进展及转移有促进作用[24]。S100A4可通过激活TLR4和NF-κB通路而诱导免疫细胞表达血清淀粉样蛋白(SA)A1与SAA3，促进肿瘤转移前微环境的形成[12]。因此，在继发转移的组织或器官中建立的炎性环境，可以有助于肿瘤细胞的定植和存活，最后形成转移病灶。

4.3 血管形成与通透性增加

转移前微环境可以促进血管的形成与通透性的增加，以促进肿瘤转移的发生。在转移前微环境中，招募促血管生成素受体TIE2+的单核细胞以及内皮前体细胞，形成了具有血管内皮生长因子(VEGFs)和其他血管生成因子较高含量的微环境，可促进肿瘤的发生发展[25]。目前研究发现黑色素瘤来源的外泌体可增加血管的通透性，还具有促进骨髓来源的前体细胞向促血管生成方向分化的作用，是黑色素瘤转移的两个促进因素[26]。在转移前微环境中，乳腺癌细胞所分泌的miR-105可抑制细胞紧密连接蛋白1的合成，从而破坏血管内皮屏障，增加血管的通透性[27]。

4.4 淋巴管的形成

淋巴管因其中的淋巴液流速较慢，且具有一定的通透性，在转移前微环境中也具有重要作用。淋巴管的形成和肿瘤转移密切相关，并且淋巴管是肿瘤淋巴转移的最初路径。肿瘤来源的VEGF-A以及VEGF-D在局部淋巴结中诱导淋巴管形成，并且与较高的淋巴结转移率发生密切相关[28]。转移前微环境中淋巴管形成后，通过淋巴管内皮细胞分泌的因子，和招募未成熟的树突状细胞和T细胞，对于肿瘤的迁移、远端转移和免疫抑制发挥着重要作用[29]。在转移前淋巴结中，黑色素瘤来源的外泌体与被膜下淋巴窦中CD169+的巨噬细胞发生融合，从而逃离了免疫攻击，进而进入淋巴结内，并与其中的B淋巴细胞共同形成促肿瘤的微环境[30]。

5 器官倾向性

器官倾向性是转移前微环境所固有的一种特性，不同类型的肿瘤有特异性的转移倾向，原发肿瘤对于选定的转移部位，通过TDSFs改造转移部位微环境，使CTCs更容易定植及发展为转移灶。如在骨形成的转移前微环境中发现有异常黏附成分，可促进乳腺癌早期的播散并进一步发生骨转移[31]。前列腺癌细胞所表达的NF-κB受体激活因子通过活化RANK/RANKL通路，可以特异性地在骨组织中建立转移前微环境[32]。通过肿瘤细胞表达的CD146通过CXCL12/CXCR4通路，调控骨组织脉管系统周围的间充质干细胞，使得黑色素瘤具有骨转移的倾向[33]。因此，在不同肿瘤的转移前微环境中含有不同的分子成分，对于肿瘤转移的器官倾向性起着重要作用。

6 重组过程

代谢的重组、基质的重组以及表观遗传的重组均参与了肿瘤转移前微环境的形成[34]。肿瘤细胞可以招募并且重组基质细胞，以促进肿瘤细胞的播散和转移。在乳腺癌中，基质细胞的重组主要是通过热休克因子1，致使CAFs转录水平发生变化。肿瘤细胞还可以激活TGF-β和SDF-1通路促进肿瘤转移[34]。肿瘤细胞来源的外泌体，还可以在转移前微环境中改造基质细胞代谢。如乳腺癌细胞来源的囊泡中富含miR-122，其可以通过降低糖代谢相关酶的活性抑制微环境中基质细胞对糖的摄取[35]，因此miR-122也可以作为预示乳腺癌发生转移的分子标记物。

7 转移前微环境参与肿瘤转移的过程

肿瘤转移是一个时空顺序的病理事件，大致可分为以下几个阶段。

7.1 初始阶段

在此过程中原发肿瘤处于一个过度增殖期，同时其周围环境处于一种炎症伴缺氧状态，使得原发肿瘤细胞产生大量的TDSFs及EVs等多种成分，这些成分可以动员BMDCs及多种免疫抑制细胞到达转移的组织或器官，以利于肿瘤转移的发生。此过程是转移前微环境形成的初始阶段，尚不完全具备接受CTCs定植的条件。

7.2 进展阶段

此阶段转移前微环境较为成熟，原发肿瘤的转移过程逐步开始，此时仍不断有原发肿瘤动员来到微环境的免疫调节细胞、TDSFs、EVs以及受其调节的BMDCs等成分。此阶段对于转移前微环境的改造，无论在持续作用时间还是作用强度方面，均已具备接收CTCs定植的条件。如诱导细胞外基质的重塑、激活的整合素以及趋化因子已经将继发转移的组织或器官改造为适合肿瘤转移发生的环境。在细胞外基质的改造过程中，IL-1β及MDSCs可以使肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)，增加肿瘤细胞侵入转移部位的能力[36]。

7.3 转移启动阶段

经历了原发肿瘤细胞对微环境的影响，成熟的转移前微环境已经建立，肿瘤细胞的转移逐步开始发生，此时CTCs离开血管、淋巴管，定植于转移微环境。在转移前微环境中大量存在的HIF-1可通过VEGF以及血小板来源生长因子(PDGF)增加对肿瘤细胞的招募作用[37]。如果患者接受了化疗、手术以及其他抗肿瘤治疗，进入微环境中的肿瘤细胞大多处于休眠状态，待条件成熟后再继续增长形成转移灶。相关研究表明，在乳腺癌骨转移的发生过程中，外泌体转运的miR-23b可以通过抑制靶基因MARCKS，而使肿瘤细胞进入休眠状态[38]。一些促进转移的因素，如免疫抑制以及细胞外基质的重塑，可以协助肿瘤细胞逃脱机体的攻击，而进入休眠状态[39]。因此，已经建立的转移前微环境，对于肿瘤细胞的定植、增殖、存活以及逐步发展为转移灶提供了必要的支持。

7.4 转移灶形成

此过程中肿瘤细胞离开原发部位定植于微环境中的数量逐渐增多，微环境中的各种细胞因子可以直接促进肿瘤细胞的增殖，因此，肿瘤的转移灶逐渐形成。如在乳腺癌骨转移过程中，骨组织微环境中异常表达的血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1)可促使乳腺癌细胞在骨组织中增长，最终导致骨转移病灶的形成[40]。同时原发肿瘤细胞所产生的分泌蛋白等成分，也会进一步促进转移灶的形成。某些蛋白的表达水平可以为肿瘤骨转移提供一定的参考，如患者血清中升高的slCAM1及miR-16/miR-378，与骨转移的发生关系密切[18]。

骨组织是肿瘤发生转移的高发部位，肿瘤在发生骨转移的过程中，骨微环境的变化起到了关键作用。因此，了解肿瘤骨转移前微环境形成的机制，对骨微环境进行监测和干预，可为在肿瘤未出现骨转移病灶时，提供早期预警，为预防肿瘤的骨转移发生。在治疗肿瘤骨转移的过程中，针对骨微环境的关键蛋白进行干预，有望与其他治疗产生协同作用，提高治疗效果。