微小RNA调控肝纤维化相关信号通路的研究进展*

高晓阳，张春艳，颜羽昕，马月宏

内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010059

肝纤维化作为全球主要公共卫生问题之一，被一致认为是由多种因素引起的慢性肝损伤的必然发展阶段。这些因素主要包括病毒性感染(乙型和丙型)、酒精性脂肪性肝炎(alcoholic fatty liver disease，ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、胆汁淤积症、自身免疫性疾病(原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎)、铁负荷、与药物有关的毒性反应、遗传代谢性疾病(血色素沉着症、威尔逊病和α1-抗胰蛋白酶缺乏症)[1-3]。在肝纤维化进展中，受损的肝实质细胞和非实质细胞会释放出各种复杂的刺激信号，如转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)等[4]。当这些细胞因子与其它炎性介质或调节因子之间形成信号通路作用在静止的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)时，HSCs将处于持续活化状态，失去储备维生素A的能力，转分化为肌成纤维细胞[5]。有报道指出，在慢性纤维增生性疾病中，肌成纤维细胞的存在是一个关键的共同特性[6]。增殖、收缩、迁移的肌成纤维细胞表现出较强的促纤维化转录和分泌特性，分泌出大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，使ECM基因表达增强，降解基因表达下降，尤其增加了Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达[7]。不足的是，有研究发现细胞因子及信号通路仅在ECM基因转录的启动阶段发挥作用，而ECM的基因转录过程或翻译水平需要有其他某种特定物质干预才能进行[8]，这种物质就是非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。

人类基因组多经转录得来，其中只有2%编码蛋白质，余多数转录组均由具有调控功能的ncRNA组成，包括miRNA、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)等[9]。目前研究较广泛的是miRNA，它通过降低mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译，实现对基因组表达的微调，对生物体发育、分化、增殖、凋亡、免疫等生理活动的精准调节[10]。并有越来越多证据表明，miRNA调控细胞增殖、凋亡、脂肪酸代谢等一系列相关信号通路，在肝纤维化中发挥重要的生物学作用[11]。在这里，我们主要通过以下几个方面的探讨，找出miRNA参与的信号通路及作用靶点，了解其与肝纤维化之间的相关性及可能存在的治疗靶点。

1 miRNA的功能与作用机制

miRNA是一种物种间高度保守的非编码单链RNA分子，长度约为21～23个核苷酸，主要通过识别同源序列和干扰转录、翻译或表观遗传过程来调控基因表达[12-13]。然而，经证实发现单个miRNA可同时靶向数百个mRNA，所以其生物学特性远比我们最初认为的要更复杂[14]。事实上，该领域的最新进展已经揭示了许多分子机制，这些分子机制在生理条件下或在疾病中以细胞依赖性方式紧密地调节着它们的生物发生、成熟和相互作用，例如RNA编辑、单核苷酸多态性、DNA甲基化、不对称miRNA链选择以及与其他编码和非编码RNA分子或RNA结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)的相互作用[15]。

1.1 RNA编辑

RNA编辑事件几乎发生在所有真核生物中，它的分子机制过程依赖不同的分类群，涉及不同的酶，最终导致不同的RNA修饰[16]。例如：腺苷到肌苷(A-to-I)编辑，是腺苷脱氨酶(ADAR)和ADAT蛋白家族的成员，是选择性剪接和转录控制的重要调节因子；胞苷到尿苷(C-to-U)编辑，作为AID/APOBEC家族的成员，与先天性免疫和获得性免疫密切相关，在抗体多样化和抗病毒应答中有不可替代的作用[17]。生理上，这些酶多数存在于细胞核和(或)细胞质中，在那里它们可以修饰各种RNA分子(包括miRNA、tRNA和mRNA等)，其中一些也可以进行DNA编辑[18]。目前与RNA编辑相关的各种疾病中，研究相对成熟的有中枢神经系统(CNS)疾病和癌症。Lorenzini等[19]从AMPA受体、血清素受体、电压门控钾通道3个方面论述了CNS RNA编辑目标，数据显示RNA编辑的调节可能与结合脑中区域的受体和细胞类型的时空特异性有关。在慢性神经病变中，AMPA受体中Ca2+渗透性增加，毒性运动神经元被兴奋致细胞死亡，也伴随着ADAR2的下调；精神疾病则主要抑制血清素或5-羟色胺(5-HT)受体，使5-HT2C受体在经历RNA编辑转录后改性，影响大脑前额叶皮质中ADAR2表达。总之，研究RNA编辑事件除了可以为识别新的疾病生物标志物铺平道路，还可能为各种疾病提供更专业、更个体化的治疗。

1.2 单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人类基因组中最常见的变异类型，其中只有位于蛋白质编码和非编码RNA基因中的功能性SNP才具有改变各种生物学过程的功能，并不断赋予疾病多因素风险[20]。到目前为止，通过对人类SNP数据库的生物信息学搜索得出，已知的SNP共有227个，其中12个位于miRNA前体内，1个位于成熟miR-125a的第8位核苷酸，并在miRNA识别mRNA靶标中发挥至关重要的作用[21]。Duan等[22]在实验中构建了miR-125a主、次等位基因的表达载体，结果表明当主要等位基因表达时，miR-125a SNP能以RNA二级结构依赖的方式将pri-miRNA加工为前miRNA；而次要等位基因表达时，miR-125a SNP可能导致碱基失配对，除了抑制miRNA介导的翻译外，还显著阻止pri-miRNA向pre-miRNA的转录后加工。与此同时，在乳腺癌miRNA图谱中也发现了miR-125a的下调。Louer等[23]研究氧化应激对各种疾病的影响过程时，发现琥珀酸受体(SUCNR1)基因转录本中有一个特殊的SNP(Rs13079080)，它主要在人类视网膜中表达，并与miRNA-4470结合于C等位基因，这时mRNA表达将降低，引发老年性黄斑变性(AMD)。

1.3 DNA甲基化

DNA甲基化是基因表观遗传学中的一种化学修饰，指生物体以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下将甲基连接到胞嘧啶环上的过程。它主要参与基因表达调控、重金属修饰、蛋白质功能调节以及核糖核酸加工等，此外甲基化状态的改变还会引起基因表达异常或染色体结构的不稳定[24]。Holubekova等[25]采用全基因组测序、微阵列等新技术证实组织特异性DNA甲基化对miRNA分子或mRNA基因表达的影响，从中获得的数据还表明了DNA甲基化模式和miRNA表达谱可以表征肿瘤组织的起源和转移潜能，是早期癌症可能观察到的较精确的预后标志物。Tao等[26]则通过对动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中miRNA和DNA甲基化的表达监控，得出AS形成的潜在机制可能与miRNA(如miR-145、miR-210、miR-124)中的DNA甲基化/去甲基化有关。反过来，DNA甲基化改变也需要miRNA通过一些与甲基化修饰相关的蛋白(如DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET2)来调节。

2 miRNA调控肝纤维化信号通路

肝纤维化的发生机制极为复杂，涉及大量的细胞和分子事件。一方面，由外源性因素刺激，使HSCs转化为肌成纤维细胞，分泌过量的ECM致肝纤维化。同时大量研究证实，肝纤维化的发生发展与整合的信号通路有关，包括TGF-β/Smads通路、Hedgehog(Hh)/Gli通路、Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路、PDGF通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路、Notch通路、Toll样受体2(TLR2)和TLR4通路等[27-28]。另一方面，受内源性调节，机体中的miRNA与靶mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)结合，抑制靶基因的转录或降低靶基因的稳定性[29]。在生物进化和发育过程中，由于miRNA序列的高度相似性，多个miRNA可以形成一个具有同源性序列的miRNA家族。miRNA家族的协同效应，无论是全局的还是单独的，都能通过与一个或几个信号通路相关分子的结合与HSCs的活化和肝纤维化的进展联系在一起。

2.1 miRNA调控TGF-β/Smads通路

TGF-β是一种主要的促纤维化细胞因子，在调控组织和器官动态平衡所必需的多种细胞过程中发挥重要作用。且TGF-β功能具有多样性和多效性，信号转导途径的失控将导致疾病的发生[30]。就肝脏而言，TGF-β通路参与疾病发展的所有阶段，从最初的肝损伤到炎症和纤维化，再到肝硬化和肝癌[31]。在现代研究中，TGF-β信号转导领域随着细胞程序间的新发现而得到拓展。现通过多种研究均证明miRNA介导的RNA干扰能与TGF-β/Smads信号通路共同表达于基因转录水平，表现为TGF-β通过调节不同的促纤维化和抗纤维化miRNA，诱导造血干细胞的表观遗传学改变，表观遗传调节因子调节TGF-β信号通路上、下游成分的活性和表达等[32]。Jiang等[33]研究了miR-29家族在肝纤维化中的表达，论证了miRNA与TGF-β/Smads信号通路的相关性，显示TGF-β信号可导致有Smads依赖性的miR-29家族成员下调，并伴随着HSCs和成纤维细胞中ECM相关基因的下调，最后把miRNA整合到由细胞因子、转录因子和其他经典细胞功能介质组成的复杂的纤维化相关网络中发挥作用。Gupta等[34]首次设计了关于TGF-β通路能否通过miRNA-181a诱导肝纤维化的实验，结果发现TGF-β在诱导miRNA-181a表达上调时，能反作用地促进HSCs的纤维化并抑制肝细胞再生，对TGF-β诱导的HSCs纤维化起抑制作用的是它们的中间产物，即碱性磷酸酶和上皮细胞钙粘蛋白。Roderburg等[35]在原代小鼠和人的肝纤维化模型中观察到，重组TGF-β能下调HSCs中的miR-133a，但对原代肝脏中的其他细胞无显著改变。此外，为了更好地阐述HSCs miR-133a下调的可能机制，他们还进行了HSCs的Smad2/Smad3转染实验，得出Smad2的转染能显著阻止依赖TGF-β的miR-133a的下调，而Smad3的影响却较小。这些数据均提示了TGF-β/Smads通路在HSCs特异性调节miR-133a中的潜在作用。Lakner等[36]则对静止和激活的大鼠HSCs进行MIR基因芯片分析，发现miR-17-92簇(19a、19b、92a)成员在活化的HSCs中均明显下调，其中miR-19b变化最大。miR-19b通过负调控TGF-β信号成分，减少TGF-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)和Smad3的表达，降低Ⅰ型胶原的表达，阻断TGF-β诱导的a1和a2前胶原mRNA的表达，最终钝化HSCs的活化表型，使α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达受到抑制。以上miRNA均将有望成为一种新的肝干细胞TGF-β信号调节因子，为治疗肝纤维化提供了一种新的思路。

2.2 miRNA调控Hedgehog(Hh)/Gli通路

Hedgehog(Hh)/Gli信号通路作为发育器官的形态原、有丝分裂原和诱导因子，在胚胎形态形成和生长调控中起关键作用。Hedgehog具有多种多样的功能，如胚胎发生、细胞增殖、细胞粘附、细胞迁移、细胞分化等，此外它还调节肝脏组织的伤口愈合反应[37-38]。这些通常通过自分泌或旁分泌信号发生，目的是控制Hedgehog反应细胞群体的大小和定位，以响应局部/远距离信号[39]。就肝纤维化过程来说，Hedgehog信号传导在促进静态HSCs转变为纤维原肌纤维细胞时，其中一些细胞能在部分肝切除后成为再生肝上皮组织的前体细胞[40]。另有研究发现静止的HSCs会产生大量的Hedgehog抑制剂(HHIP)，相反，当HSCs在某种刺激下向其激活态过渡时，HHIP将迅速下调，致使Gli2靶基因表达增加[41]。最新研究已将Hedgehog(Hh)/Gli信号通路对肝纤维化组织的调控与miRNA的表达相关联，调节Hedgehog的miRNA能诱导HSCs失活并减少肝纤维化发生。Ma等[42]发现在四氯化碳(CCl4)处理的肝纤维化模型、高脂饮食(high fat diet，HFD)诱导的脂肪性肝炎小鼠模型和肝硬化患者中，miR-214的表达会随肝纤维化的进展而不断上调，所以他们认为miR-214是肝纤维化中最显著的miRNA上调基因。在机制上，miR-214的表达还受到转录因子Twist1的控制。当Twist1与miR-214启动子中的E-box元件结合，miR-214能通过抑制Hedgehog(Hh)/Gli信号途径中Sufu的表达来增强HSCs的活性及调节自身过表达，从而加快纤维化病理进程。Sun等[43]得出miR-9通过直接靶向Hedgehog(Hh)途径中多药耐药相关蛋白1(MRP1/ABCC1)的3′-UTR，抑制HSCs的增殖能力和ECM相关基因(α-SMA、COL-1和TIMP-1)的表达水平，在治疗肝纤维化中发挥重要作用。

2.3 miRNA调控Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin通路是一种在进化上比较保守的细胞信号系统。曾有研究报道指出Wnt/β-catenin通路在许多正常的未受刺激的成体细胞中是不活跃的，而确保这一稳态平衡的是Wnt蛋白的缺失和β-catenin的降解[44]。近期，来自器官纤维化研究的新证据表明，Wnt/β-catenin信号途径的持续激活与人类纤维化疾病的发病机制有关，如肺纤维化、肾纤维化和肝纤维化[45]。而这里我们主要总结Wnt/β-catenin通路与HSCs活化、增殖、凋亡的关系。Yang等[46]在对锌指蛋白家族的研究中得知，锌指E盒结合同源框1(ZEB1)作为一种转录抑制因子，通常正向调节Wnt/β-catenin信号通路，促进造血干细胞的激活和纤维化形成。但这种调控机制常常受到miR-708表达的干扰，当miR-708在活化的HSCs和肝组织中的表达受到抑制，将伴随ZEB1增加；而miR-708的过表达又会以负向调节Wnt/β-catenin信号通路的形式使ZEB1下调，并降低HSCs的激活和增殖。Yu等[47]在CCl4诱导的肝纤维化和活化的HSCs中检测到miR-378a-3p的表达，发现miR-378a-3p下调是导致胶原蛋白过量积累致纤维化的重要原因，上调可抑制HSCs的活化、增殖及α-SMA的表达，过表达时Wnt/β-catenin信号途径完全被阻断。Wnt/β-catenin途径中的Wnt10a成员是miR-378a-3p的靶标，转染后的miR-378a-3p细胞会降低Wnt10a的mRNA和蛋白表达。总之，研究数据证明miR-378a-3p可通过抑制Wnt10a来抑制HSCs活化/增殖而抗纤维化。Yu等[48]除分析了miR-378a-3p对HSCs活化及Wnt/β-catenin通路的影响，还开展了miR-17-5p激活与Wnt/β-catenin通路间的研究。miR-17-5p是miR-17-92家族中的成员之一，过表达时能促进HSCs的活化和增殖，增加原代造血干细胞中α-SMA和结蛋白的水平。在该发展机制中还存在一个关键的靶点WIF1，miR-17-5p的上调或下调均需要负向调节WIF1来决定Wnt/β-catenin通路的活性。

2.4 miRNA调控NF-κB通路

核因子-κB(NF-κB)属于二聚体转录因子家族，常在不同信号通路中作为整合因子(控制核定位和翻译后修饰)来微调NF-κB反应的转录水平，主要参与协调细胞的炎症反应、免疫应答及分化和增殖等[49]。随着学术界对NF-κB通路的进一步探索，发现NF-κB信号通路能通过促进一些直接或间接激活HSCs的炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)、趋化因子、炎性基因及TGF-β基因的表达，在肝纤维化的发生机制中起作用[50]。Zhang等[51]研究显示在HFD小鼠模型和脂肪性肝炎患者的肝脏中均有miR-378家族的上调，使肝细胞衍生的促炎介质合成增加，肝脏炎症加重。除此之外，还发现miR-378家族能显著增强NF-κB的活性和激活肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达，加快肝纤维化演化进程。所以常常把miR-378家族作为是脂肪性肝炎肝纤维化治疗的关键点。Kim等[52]和Zhang等[53]均提出了miR-125b是NF-κB的直接转录靶点的观点。在肝纤维化中，miR-125常直接靶向肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)来促进NF-κB介导的炎症反应。然而当他们将miR-125b抑制剂与TNFAIP3 siRNA共同作用在NF-κB信号通路上时，发现单独的miR-125b抑制剂能大大改善肝纤维化诱导的肝损伤和炎症反应，但与TNFAIP3 siRNA共同治疗反而会促纤维化。Zou等[54]发现miRNA-146a-5p也是治疗肝纤维化的潜在靶点。在CCl4处理的原代大鼠HSCs自然激活期间会下调miRNA-146a-5p和上调肠源性内毒素(IET)，通过靶向抑制NF-κB信号传导通路上的IL-1受体相关激酶1(IRAK1)和TNF受体相关因子-6(TRAF6)，能间接抑制TGF-β/Smads信号通路并阻断肝纤维化进程。

2.5 miRNA调控其他信号通路

Matsumoto等[55]研究发现miR-29a是体内少有的无细胞毒性的抗纤维化基因，能直接调节Ⅰ型胶原α1(COLI-α1)和血小板衍生生长因子C(PDGF-C)的mRNA表达，显著抑制LX-2细胞系中COLI-α1 mRNA表达和诱导LX-2细胞凋亡。Yang等[56]确定了miR-26b-5p在肝纤维化和血管生成中的重要作用。miR-26b-5p在纤维化肝脏中表达下调，与PDGFR-β和血管生成标志物呈负相关，过表达时减少PDGFR-β mRNA和蛋白的上调，抑制体内HSCs活化和血管生成。miR-26b-5p还可以与lncRNA母系表达的基因3(lncMEG3)相互作用，抑制肝纤维化和血管再生，这将可能是肝纤维化的有效治疗策略。Lei等[57]实验证明在体外肝纤维化模型中，miR-101是一种有效的抗纤维化因子，它可以显著抑制HSCs的活化和增殖，减少ECM积聚，改善肝功能。而在CCl4诱导的肝纤维化小鼠体内过表达miR-101后，PI3K/Akt信号通路被抑制甚至失活，且肝脏中p-PI3K、p-Akt水平显著下调。总结体内体外两种结果，发现抑制PI3K/Akt信号通路可能是miR-101抗实验性肝纤维化的机制之一。Yang等[58]报道HSCs激活模型中的SIRT1不仅是调节miR-200a的新靶点，而且对Notch信号途径的表达具有负性调节作用。在活化的HSCs中，miR-200a的缺失与SIRT1上调和Notch1下调相关，SIRT1下调增加了Notch1-细胞间域(NICD)蛋白的表达，反之，Notch的mRNA和蛋白水平的改变也可能在SIRT1影响Notch活性的降低中起作用。

3 miRNA相关的抗纤维化治疗

肝纤维化是多数慢性肝病患者发展为肝硬化、肝癌的必然阶段，它的预防或逆转已成为新型肝脏特异性药物临床试验的主要终点[3]。我们可以从胶原合成、整合素和细胞及其特异性机制等多个方面着手[59]，在基于miRNA表达上来研究治疗肝纤维化的潜在方法。

miRNA是一种很有吸引力的治疗方法，因为miRNA能够靶向多个基因，有助于同时操纵多个代偿途径。但将治疗性miRNA递送到相关靶组织中仍是一项艰巨的任务，一些已用于病毒性感染、ALD、NAFLD治疗的miRNA模拟物和抗miRNA还处于Ⅰ期试验或Ⅱ期试验[60]。Kumar等[61]实验发现Hedgehog抑制剂(GDC-0449)和miR-29b1均能抑制促纤维化基因，便设想若将miRNA和化合物组合是否有协同治疗效果。结果证实与单独使用miR-29b1治疗的小鼠相比，将miR-29b1和GDC-0449包裹的纳米颗粒输送到小鼠肝纤维化模型中，在靶向胶原沉积和改善肝损伤血清标志物方面都产生了更好的效果。RG-101是一种与肝细胞靶向N-乙酰半乳糖胺偶联的抗miR-122注射剂，Ⅰ期实验已证实RG-101可以显著降低慢性丙型病毒感染患者体内的病毒载量，从疾病早期阻断其向纤维化转变；Ⅱ期实验研究还在进行中，目的是确定RG-101与直接作用抗病毒药物联合使用是否可以缩短疗程且达到治疗效果[62]。Lou等[63]曾大胆推测miR-122修饰是治疗肝纤维化的一种新的潜在策略。他们调查发现单纯的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植可能不足以治疗肝纤维化，便鉴于miR-122对HSCs增殖和反式激活的负性调节作用，利用慢病毒介导的前miR-122转染构建了miR-122修饰的AMSC(AMSC-122)，结果表明miR-122修饰不但抑制了HSCs的活化和减少胶原蛋白的沉积，而且能增强AMSC在治疗CCl4诱导的肝纤维化中的疗效。

4 问题与展望

miRNA是肝纤维化研究领域中一种很有前景的新方向，但以人类现有的技术条件，想把miRNA真正应用于临床实践之中，还需要跨越许多障碍。现阶段，大多数研究都是作为单中心研究进行的，只包括少数患者。而且由于qPCR和基于微阵列的测量依赖于miRNA特异性引物或微阵列探针的设计，不同miRNA之间的相似性可能会导致研究之间的比较更困难、更难以分辨。此外，数据归一化问题也有待解决，主要是由于人类血清样本中缺乏固有的有效的RNA管家基因，以及miRNA定量效率的平台间差异较大，导致研究之间的可比性差[64]。最重要的是，到目前还没有就样本收集、数据标准化和分析的最佳方案达成共识。以我们研究miRNA、信号通路与肝纤维化之间的相关性来讲，也存在着一些问题。首先，单一miRNA与miRNA家族对肝纤维化是否具有一样的影响，在靶向治疗上是否可以相互替代；其次，当不同miRNA家族作用于同一信号通路的相同靶标时，作用是加强，还是相互拮抗；最后，从实践应用角度来看，miRNA作为治疗手段，是否可以被大多数患者接受。

总而言之，只有克服目前的局限性，miRNA才有可能进一步运用于诊断及治疗中，上调或下调miRNA家族的表达也将是未来治疗肝纤维化的最有前景的方法。