羽扇豆醇抗肿瘤作用的潜在分子通路

孟桂先，李润瑜，赵一帆，赵红伟，付昕超，张 壮，赵 臣

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

随着中药抗癌的发展，中药与中医疗法在治疗肿瘤过程表现出副作用小、痛苦少、生存质量高等优点，并可以与放疗、化疗、靶向药物等形成各具特色的联合疗法，提高了肿瘤患者的生存率。中药组分的抗肿瘤特性得到广泛关注，例如紫杉醇、白藜芦醇、羽扇豆醇等。羽扇豆醇属于五环三萜醇化合物，主要来自蒲公英、鲁冰花种皮、木棉树皮、狼毒大戟等中草药，并在草莓、橄榄、葡萄、芒果、无花果、红树林等可食用水果与蔬菜中广泛存在，具有较强的止痛、消炎、抗疟疾、抑制基因突变、促进皮肤愈合的作用，具有明显的抗肿瘤活性[1-3]。但是，羽扇豆醇抗肿瘤机制尚不清楚。本文对羽扇豆醇抑制肿瘤机制的研究进行综述，总结了羽扇豆醇抗肿瘤作用潜在的多种机制通路。

1 羽扇豆醇的抗肿瘤作用

研究表明，羽扇豆醇对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、白血病等多种恶性癌症与肿瘤细胞具有明显的抑制作用，并且在延缓肿瘤复发、降低耐药性与抗放疗性中效果显著[4]。Hata[5]等以羽扇豆醇对人类骨髓样白血病HL60、U937、K562进行处理，通过MTT与Hoechest、Annexi-Ⅴ染色检测发现羽扇豆醇对三种白血病细胞具有明显的生长抑制与诱导凋亡作用。与对照组相比，羽扇豆醇对耐药的K562细胞株具有相同的诱导凋亡作用。王明[6]等利用细胞黏附、划痕实验、Transwell实验发现羽扇豆醇对人乳腺癌MDA-MB-231细胞转移具有抑制作用，且相关蛋白COX-2、MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的表达均下调。此外，羽扇豆在诱导癌细胞凋亡的同时，对正常的人体细胞没有毒害作用[4]。因此，羽扇豆醇抗癌活性的应用与研发已经成为当代肿瘤中医治疗研究的关注热点。

2 羽扇豆醇抗肿瘤的多种潜在分子通路

目前研究已证实羽扇豆醇具有抗肿瘤活性，但对癌细胞的抑制作用却不尽相同，存在多种信号通路与作用机制，其中包括各种凋亡蛋白相关的信号通路，细胞周期阻断的相关通路，下调转录的NF-κb通路、RhoA-ROCK1(丝氨酸/苏氨酸激酶)通路、MAPK通路等。除此以外还包括microRNA有关的信号通路，以及炎症反应有关的巨噬细胞招募调控的间接抑制机制等。按照羽扇豆醇对癌细胞的不同作用机制，对相关信号通路进行分类归纳。

2.1 Bcl-2/bax/caspase凋亡通路

Bcl-2/bax/caspase-3(胱天蛋白酶-3)等凋亡蛋白是羽扇豆醇促进肿瘤细胞凋亡重要分子。例如，Eldohaji[3]等发现羽扇豆醇可以显著降低Hep3B肝癌细胞Bcl-2基因表达，大量激活caspase-3进而诱导肝癌细胞死亡。Prabhu[7]等在膀胱癌细胞中发现羽扇豆醇诱导促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原PCNA在膀胱癌中表达，进而达到抑制大鼠膀胱肿瘤生长的目的。在伴随Bcl-2/bax/caspase-3起作用的同时，羽扇豆醇还可以促进活性氧生成、线粒体膜电位丧失介导凋亡，并通过抑制AKT/PKB通路来促进人表皮样癌凋亡[8]。Parames[9]等发现羽扇豆醇通过线粒体动力学凋亡途径有效诱导细胞SK-RC-45凋亡与自噬。40 μmol/L羽扇豆醇作用48 h，凋亡相关蛋白caspase-3表达量升高，细胞抑制率增加，细胞自噬程度增强，敲低抗凋亡蛋白Bcl-2可以显著提高羽扇豆醇的疗效。此外，羽扇豆醇还可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[10]。

2.2 cFIP-caspase-3/8-TRAIL凋亡通路

下调抗凋亡因子cFIP(转换酶抑制蛋白)，提高凋亡蛋白caspase-3/8的活性，增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体Trail表达水平(cFIP-caspase-3/8-Trial)分子通路，是羽扇豆醇启动和增加肿瘤细胞凋亡的途径之一。Yan[11]等发现羽扇豆醇对原发性肝癌HCC细胞株SMMC7221和HepG2的凋亡作用，伴随凋亡蛋白caspase-3上调，PARP(DNA修复酶)的水平增加，凋亡配体TRIAL表达增强。罗冠琴[12]等也证实羽扇豆对胰腺癌细胞SW199的促凋亡作用，是通过下调cFIP、提高caspase-8蛋白活性、增加TRAIL实现的。此外，Murtaza[3]等利用cFLIP过表达细胞验证羽扇豆醇的效果，发现羽扇豆醇通过TRAIL致敏化诱导耐药的胰腺癌细胞凋亡，可成为胰腺癌潜在的备选药物。

2.3 AKT/PKB通路

PI3K/AKT/PKB通路也是羽扇豆醇分子机制之一。AKT/PKB是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它的激活与肿瘤发生、肿瘤血管生成密切相关，并参与调节细胞凋亡、细胞周期调控等。AKT通路诱导凋亡重要靶点就是BAD/Bcl-xL。AKT激活后，直接磷酸化Bcl-2家族成员BAD(促凋亡)136号位点，促进BAD脱离Bcl-2/Bcl-xL复合物，与蛋白14-3-3结合，从而发挥Bcl-2/Bcl-xL的抗凋亡活性[14]。同时AKT可以抑制蛋白水解酶caspase-9活性，阻止凋亡通路启动。羽扇豆醇可以抑制AKT/PKB通路，阻断BAD磷酸化，抑制细胞的抗凋亡活性，从而增加人表皮癌细胞凋亡概率[8]。PI3K/AKT激动剂(IGF-1)可以中和羽扇豆醇对胰腺癌细胞PANC-1凋亡作用，也证实PI3K/ATK通路是羽扇豆醇抗肿瘤机制的靶点之一[15]。

2.4 核因子κB信号通路

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种核转录因子，通过控制目的基因(如基质金属蛋白酶家族MMPs)表达来控制细胞的生长、分化、衰老、凋亡过程，调节肿瘤细胞分型、转移，几乎参与所有的细胞信号转导(PI3K/AKT、MAPK等)[16]。研究证明，羽扇豆醇可以下调NF-κB p65的表达，降低金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和COX-2的表达，进而抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭转移[6，17]。羽扇豆醇也可通过NF-κB介导的炎症反应与免疫微环境调整起到抗肿瘤作用。研究发现在高剂量羽扇豆醇使用后的小鼠胃癌组织中NF-κB p65降低，炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α的水平降低，肿瘤组织中CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg、NK等细胞被大量消耗，肿瘤大小得到有效控制[18]。NF-κB下调还是羽扇豆醇抑制肿瘤转移的主要机制之一。羽扇豆醇可以通过抑制NF-κB依赖性的上皮-间充质转化来削弱头颈部鳞状细胞癌HNSCC细胞的侵袭能力，从而有效降低小鼠原位移植瘤的局部侵袭和淋巴转移[19]。在人表皮样癌A431细胞中，羽扇豆醇可以通过上游的NF-κB抑制蛋白与NF-κB结合，促使NF-κB分子脱离特定DNA结合位点，从而阻断NF-κB通路活性[9]。在口腔鳞状细胞癌细胞中，羽扇豆醇通过EGFR通路抑制下游的NF-κB分子和PKB/AKT，进而诱导凋亡[20]。这都证明NF-κB分子在羽扇豆醇抗肿瘤特性的关键作用,并与多种信号通路共同发挥作用，如PKB/AKT、MAPKs、Ras等。羽扇豆醇处理后，胰腺癌细胞中Ras癌蛋白明显降低，NF-κB分子通路活性明显被抑制，PI3K/AKT与MAPKs各种信号分子的蛋白表达都被消弱。羽扇豆醇采用多种通道共同作用的方式诱导凋亡发生[21]。

2.5 miroRNA通路

miRNA也成为细胞凋亡的重要调节分子，例如抑癌的miRNA-34a和致癌的miRNA-21。郭敏[22]等发现羽扇豆醇作用后，抑癌的miRNA34增加，下游靶点c-Myc基因表达下调，伴随Bcl-2降低，抑癌基因p53上调，肿瘤细胞凋亡。miRNA21是现在研究较为深入的致癌miRNA，也是羽扇豆醇作用的靶点分子之一。miRNA-21可通过下游靶标程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD-4)抑制癌细胞转移。唐泽严[23]等研究表明，羽扇豆醇可以降低miRNA-21表达，增加PDCD-4表达，增加下游调控因子c-Jun磷酸化及AP-1活性，上调侵袭相关蛋白酶MMPs转录表达，进而增加癌细胞凋亡，限制增殖，抑制转移。miRNA212-3p也是羽扇豆醇的靶点之一。miRNA212-3p可通过抑制结构性转录因子HMGA2控制恶性上皮型肿瘤转移。Zhong[24]等的研究证实羽扇豆对骨肉瘤的抑制机制就是通过高表达miRNA212-3p靶向抑制HMGA2的作用来实现的。

2.6 细胞周期阻断通路

细胞周期阻断也是羽扇豆醇抗肿瘤机制的体现，主要是通过抑制细胞周期蛋白或者细胞周期蛋白激酶起作用，包括阻断G2/M期[25]，诱导S期停滞[26]，G1期停止[19，27]，阻断G0/G1期[15]等。Nigam[25]等发现羽扇豆醇可诱导小鼠皮肤癌细胞G2/M期停滞持续72 h，并通过细胞周期蛋白B调节的信号通路介导，信号通路涉及p53、cdc2和细胞周期蛋B等，同时伴随bax、capase-3上调，Bcl-2和survivin下调。Prasad[26]等发现羽扇豆醇可以通过抑癌基因p16抑制细胞周期蛋白激酶CDK将周期阻断在G1/S期。在头颈癌细胞中，羽扇豆醇也可启动p53/p16凋亡途径。p16可抑制下游细胞周期蛋白D1表达从而让细胞停滞G1期，阻断分裂[20]。羽扇豆醇还可以通过上调P21和P27，下调细胞周期蛋白D1，在G0/G1期显著抑制细胞增殖，并诱导胰腺癌PCNA-1细胞凋亡和细胞周期停滞[15]。

2.7 Wnt通路

羽扇豆醇可以通过Wnt通路抑制肿瘤[27]。例如肝癌HepG2细胞中，羽扇豆醇促使Wnt3(一组编码调节胚胎发育的分泌蛋白质)和β-连环蛋白的表达降低，细胞周期停止，细胞凋亡[28]。羽扇豆醇还可以通过Wnt通路与AKT通路一起抑制胃癌细胞，并增加NK细胞数量来杀死肿瘤细胞[29]。

2.8 RhoA-Rock1信号通路

RhoA-Rock1通路是羽扇豆醇抑制肿瘤生长与转移的重要路径之一。Rhock活化以后促进下游底物肌球蛋白轻链磷酸酶磷酸化，刺激肌球蛋白与肌动蛋白交联，增强肌动蛋白收缩，从而促进细胞迁移[30]。羽扇豆醇通过抑制RhoA-ROCK1信号通路，下调结肠癌细胞内RhoA、ROCK1及β-连环蛋白表达水平，抑制结肠癌细胞增殖[31]。Jiang[32]等发现经过羽扇豆醇处理过的结肠癌细胞HCT116和SW620，肌动蛋白应激纤维网络减少，细胞骨架变化，肿瘤迁移能力下降，同时RhoA、RhoC及其下游效应子Rock1、丝切蛋白和磷酸化肌球蛋白轻链表达均有下降。这些结果证明羽扇豆醇通过RhoA-Roch1通路，重塑肌动蛋白细胞骨架来实现抑制肿瘤迁移的目的。

2.9 MAPK通路

MAPK通路也是羽扇豆醇抑制肿瘤转移的机制之一[33]。Bhatt[34]等的研究结果表明，羽扇豆醇可以通过降低MAPK通路中下游的ERK，抑制肺癌A549的转移。羽扇豆醇在人乳腺癌细胞MCF-7中，可以降低磷酸化后的ERK1/2、JNK和P38，延长细胞周期和降低增殖速度[35]。还有研究表明羽扇豆醇可以降低人骨肉瘤细胞的p-p38来使其凋亡[36]。

2.10 炎症反应有关的巨噬细胞招募调控的间接抑制机制

羽扇豆醇还可以通过炎症反应招募巨噬细胞间接抑制肿瘤迁移。例如Hsu等的研究[37]显示，羽扇豆醇可以抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1介导的巨噬细胞招募，减弱M2巨噬细胞极化，从而抑制癌细胞迁移。羽扇豆醇作用后，IL-4和IL-13诱导的STAT6磷酸化减少，阻断STAT6活性抑制M2巨噬细胞极化，这导致癌细胞迁移减少。

综上所述，羽扇豆醇的抗肿瘤特性不是依赖单一的分子通路，而是多靶点、多通路协同作用，这样可以阻断肿瘤发生发展的多途径网络，表现出强大的抗肿瘤潜能，成为中药组分中抗肿瘤药的重要备选，具有极大的开发前景。