肝细胞癌患者血清SPINK1、SEMA-3B表达及其预后的相关性研究*

古乾权 程 财 王 波 杨 春

1.重庆医药高等专科学校附属第一医院普外科 (重庆， 400000) 2.重庆市第十三人民医院肝胆乳甲外科

原发性肝癌是起源于肝脏上皮或间叶组织的肿瘤，是消化道常见的恶性肿瘤之一。肝癌患者早期症状不明显，随着疾病进展，患者可出现肝区疼痛、腹胀、消瘦乏力等症状，若疾病发展到晚期，患者可出现腹水、黄疸和恶病质等表现，甚至危及生命[1]。据报道称，肝癌发病率呈现逐年上升的趋势，每年大约有38万人死亡[2]。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal1(SPINK1)是一类具有 Kazal 结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其可通过MAPK信号通路，磷酸化 EGF 受体蛋白来刺激细胞的生长，并在肿瘤的发生发展过程中发挥自分泌生长因子的作用[3]。王宗艳等[4]发现胃癌组织中SPINK1高水平表达可促进患者的病程进展，也是预测患者不良预后的危险因素。信号素-3B(SEMA-3B)属于信号素家族成员之一，在多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[5]。目前，关于联合检测SPINK1、SEMA-3B评估与肝癌患者预后状况的报告较少。因此，本研究通过检测肝癌患者血清SPINK1、SEMA-3B表达水平，分析其与肝癌患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2016年12月重庆医药学等专科学校附属第一医院普外科收治的原发性肝癌患者120例(观察组)，其中男77例，女43例；年龄40～78岁，平均(56.89±7.21)岁。选取同期体检健康者100例为对照组，其中男52例，女48例；年龄40～75岁，平均(55.13±9.42)岁。两组受试者的年龄、性别一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已通过我院医学伦理委员会审批。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①均符合原发性肝癌的诊断标准[6]，均行肝癌根治性切除术，并经病理确诊为肝细胞癌；②均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗；③均为首次治疗；④临床病理资料完整；⑤患者及其家属均签署知情同意书。排除标准：①转移性肝癌者；②合并其他器官恶性肿瘤者；③严重心肝肾等器官功能不全者；④存在自身免疫性疾病或血液系统疾病者；⑤严重精神疾病，不能配合者。

1.3 临床资料收集 收集肝癌患者的临床病理资料，包括肿瘤直径、病灶数目、TNM分期、组织分化程度、门静脉癌栓、淋巴结转移等。

1.4 血清SPINK1、SEMA-3B检测 患者入院24 h内及术后1周空腹状态下抽取外周静脉血5 ml，3 500 r/min 离心10 min，分离上层血清，置于-70℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附法检测血清SPINK1、SEMA-3B水平。血清SPINK1试剂盒购自美国R&D公司，血清SEMA-3B试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司。所有操作均按照试剂盒说明书严格进行。

1.5 随访 通过电话或门诊等方式对肝癌术后患者急性为期3年随访，术后第1年每2个月随访1 次，术后第2～3年每3个月随访1次，记录患者术后生存情况，随访期间患者出现死亡即随访终止。根据患者随访期间预后状况，分为预后良好组(n=78)和预后不良组(n=42)。

2 结果

2.1 受试人群血清SPINK1、SEMA-3B水平比较 见表1。

表1 受试人群血清SPINK1、SEMA-3B水平比较

2.2 不同预后的肝癌患者临床临床资料比较 见表2。

表2 不同预后的肝癌患者临床资料比较

2.4 影响肝癌患者不良预后的多因素分析 多因素Logistic回归分析结果显示，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、淋巴结转移、血清SPINK1升高和SEMA-3B降低是影响肝癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响肝癌患者不良预后的多因素分析

2.5 血清SPINK1、SEMA-3B对肝癌患者不良预后的评估价值 ROC曲线结果显示，血清SPINK1预测肝癌患者不良预后的AUC为0.830(95%CI=0.760～0.917，P<0.001)，截断值为53.89 mg/L，敏感度和特异度为0.785、0.764；血清SEMA-3B预测肝癌患者不良预后的AUC为0.842(95%CI=0.762～0.922，P<0.001)，截断值为141.26 ng/ml，敏感度和特异度为0.800、0.706；二者联合检测预测肝癌患者不良预后的AUC为0.901(95%CI=0.831～0.967，P<0.001)，敏感度和特异度为0.692、0.912。见图1。

图1 血清SPINK1、SEMA-3B预测肝癌患者不良预后的ROC曲线

3 讨论

肝癌的发病率逐年升高，已成为严重危害人们生命健康安全的恶性肿瘤之一[7]。近年来，随着医疗技术的快速发展，肝癌的治疗也较为成熟，但患者仍存在高复发率和高死亡率，严重影响患者的生存预后。因此，准确地评估肝癌患者预后状况，并对患者尽早采取合理干预措施，对提高患者的生存率具有重要的临床意义。

SPINK1也称为肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂(TATI)或胰分泌胰蛋白酶抑制剂(PSTI)，位于5q32染色体上，约7.5 kb长，包含四个外显子，是由56个氨基酸组成的分泌肽，其主要作用是抑制多种胰腺丝氨酸蛋白酶的活性，与炎症、细胞增殖以及癌症的发生发展密切相关。SPINK1与EGF结构相似，可与EGF受体相结合，激活EGFR/PI3K/Akt 信号转导通路来参与EMT的发生[8]。同时，SPINK1与EGFR协同通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)-ERK-c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路促进大鼠正常肝细胞株的增殖或癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，并调控甘氨酸、丝氨酸等代谢通路；也可通过MEK-ERK通路下调上皮钙黏蛋白，导致EMT，进而促进恶性肿瘤转移[9]。既往研究证实，敲除SPINK1蛋白可降低恶性肿瘤浸润及转移[10]。研究发现，SPINK1可促进人肺腺癌细胞的增殖，且SPINK1表达升高与患者预后不良有关[11]。本次研究显示，肝癌患者血清SPINK1水平明显高于健康对照组，肝癌治疗后血清SPINK1水平低于治疗前，差异有统计学意义，提示SPINK1与肝癌的发生密切相关，与Zhu等[12]报道相一致。SEMA-3B是一种分泌型蛋白质及肿瘤抑制基因，是在氨基末端含有高度保守的Sema结构域的分泌分子，其可与多种细胞表面受体如神经纤毛蛋白、丛状蛋白相结合，参与神经元轴突导向的负向调控，并促进细胞迁移、肿瘤生长，也可竞争性地抑制VEGF促进肿瘤血管生成的功能。同时，SEMA3B作为一种肿瘤生长抑制剂，在致癌过程中，SEMA3B功能丧失可导致肿瘤发生发展。研究发现，肿瘤微环境细胞以及肿瘤细胞本身中SEMA-3B表达的降低可能会增加恶性肿瘤的侵袭性[13]。研究表明，SEMA-3B作为抑癌基因，可通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡等方式抑制胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的生长[14]。Dziobek等[15]报道称，SEMA-3B在子宫内膜癌组织中呈现低表达，与子宫内膜癌变密切相关。Li等[16]报道称，肝癌患者血清SEMA-3B水平明显低于健康对照组，与本次研究相一致。

本次研究结果显示，肝癌患者预后不良组血清SPINK1水平高于预后良好组，血清SEMA-3B水平低于预后良好组，差异有统计学意义，提示血清SPINK1、SEMA-3B水平变化与肝癌患者的预后不良密切相关。严荣荣等[17]报道称，肝癌患者血清SPINK1水平明显升高，并对肝癌患者的短期不良预后有较高预测价值。多因素Logistic回归分析示，血清SPINK1升高和SEMA-3B降低是肝癌患者不良预后的重要危险因素，说明入院时患者血清SPINK1值越高、SEMA-3B值越低，患者死亡风险越大。淋巴结转移及TNM分期较高的患者通常肿瘤恶性程度较高、侵袭性强、容易发生转移，患者预后越差[18]。本研究发现，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移是肝癌患者预后不良的危险因素。ROC曲线示联合检测血清SPINK1、SEMA-3B预测肝癌患者不良预后的AUC为0.901，均高于单独检测，提示联合检测血清SPINK1、SEMA-3B对评估肝癌患者的预后状态有较高临床价值。

综上所述，肝癌患者的血清SPINK1水平升高和血清SEMA-3B水平降低，血清SPINK1升高、 SEMA-3B降低是肝癌患者预后不良的重要危险因素，而二者联合检测对预测患者的不良预后有较高临床价值，可以作为肝癌患者术前评估的参考指标。但是，本研究也存在一定的局限性，样本量较少，且为单中心研究，随访时间也较短，研究结果可能存在一定的偏倚，后续还需扩大样本量进行多中心、前瞻性的数据加以研究论证。