超声波处理对糯米全粉凝胶特性的影响及其机制

杨秋晔，刘亚伟，刘 洁

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

糯米是经糯稻去壳加工而成的米，呈不透明或者半透明的白色。糯米中主要含支链淀粉（占总淀粉质量的98%）[1]和少量直链淀粉（占总淀粉质量1.0%～2.3%）[2]。糯米粉加水调成团经蒸煮糊化冷却后可形成凝胶，糯米粉凝胶具有黏度大、不易回生且透明度较高等特点[3]，因此常被亚洲人用于制作汤圆、粽子、年糕、糍粑等传统食品。糯米粉凝胶具有良好的冻融稳定性[4]，有利于冷冻食品在冻融循环过程中保持水分，相较于其他稻米粉，更适宜冷冻食品的制作。目前许多糯米粉凝胶制品例如汤圆，在冷冻处理以及保藏过程中会出现不同程度的脱粉、开裂、塌陷以及煮制后黏牙等现象，严重影响了汤圆的品质。这是因为糯米粉团缺乏延展性且本身持水性较差，使得粉团内部水分分布不均匀，在冷冻过程中由于热量交换，糯米粉团内的水分迅速冷冻产生冰晶使得汤圆皮发生脱水收缩；同时，馅料内的水分结冰膨胀形成内压从而引起汤圆皮开裂和脱粉[5]。目前工业上改善糯米凝胶的方法主要为使用添加剂，如添加乳化剂、增稠剂和复配食用胶[6]。糯米全粉中淀粉质量分数达80%以上[7]，蛋白质质量分数为6%～8%[8]，因此糯米全粉凝胶的性质主要由淀粉主导，但越来越多的研究表明糯米全粉中蛋白质的组成及含量对糯米全粉凝胶的流变学和质构特性有显著影响[9]，蛋白质对凝胶的影响主要是由于蛋白质会嵌入在淀粉颗粒内部或以网络形式黏附在淀粉颗粒表面，造成空间位阻增大，使淀粉不易糊化，抑制凝胶的形成[10]。

超声波是一种频率高于人类听觉阈值（＞16 kHz）的声波[11]，其频率范围为2×104～2×109Hz[12]。高功率（＞5 W/cm2）超声波已在食品工业中广泛使用。超声波辅助提取淀粉时，能够破坏蛋白质与淀粉之间的联结促进蛋白质与淀粉分离。近年来，关于超声波处理淀粉、蛋白质的研究已有很多。然而，关于超声波处理淀粉与蛋白质共存的全粉的研究鲜有报道。本实验以糯米全粉为原料，以反映糯米全粉凝胶黏弹性的损耗角正切值（tanδ）为指标进行正交优化试验，考察糯米全粉凝胶的制备条件，研究超声波处理对糯米全粉凝胶特性及其对糯米全粉中的主要组分淀粉和蛋白质的影响，进一步探讨超声波处理对糯米全粉的作用机制，为超声波绿色加工技术在糯米全粉的生产和加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米全粉（淀粉质量分数84.34%、蛋白质质量分数6.95%、灰分质量分数0.17%、脂肪质量分数0.82%、水分质量分数7.67%，由实验室测定） 河南黄国粮业股份有限公司。

三氯乙酸 天津天力化学试剂有限公司；β-巯基乙醇天津大茂化学试剂有限公司；5,5’-二硫基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 仪器与设备

非接触式超声波破碎仪 比利时Diagenode公司；DHR-1流变仪、TA Q20差示扫描量热仪 美国TA公司；Quanta250扫描电子显微镜 美国FEI公司；Nicolet 傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Scientific公司；快速黏度分析仪 瑞典Perten公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波处理糯米全粉

1.3.1.1 超声波处理糯米全粉的制备

称取一定量糯米全粉配制成不同质量浓度的糯米全粉乳液于50 mL离心管中，漩涡振荡均匀，置于恒定频率20 kHz的超声波破碎仪中（工作30 s停止30 s），在一定的超声波功率下处理不同时间。在超声波处理过程中，通过向水槽中加入碎冰使温度保持在0～9 ℃。将超声波处理后的糯米全粉乳液抽滤，于45 ℃烘箱中干燥12 h后过80 目筛，制备成超声波处理糯米全粉（ultrasound treated waxy rice flour，UT-WRF）。

1.3.1.2 凝胶损耗角正切值测定

称取一定量糯米全粉样品制备水分质量为52%的粉团，然后用保鲜膜包裹，以免在制作过程中发生干裂。称取5 g粉团揉搓至圆形，用保鲜膜包裹，放置5 min，将粉团放入蒸锅中蒸制15 min，冷却至室温，制备凝胶。将制备好的凝胶切成厚度约为1 cm片状，置于流变仪载物台上，选用直径为40 mm的平行板夹具，在动态频率扫描、温度25 ℃、应变1%（在线性黏弹区范围内）、频率扫描范围0.1～10 Hz条件下，测定凝胶储能模量（G’）、损耗模量（G’’）以及tanδ（G’’/G’）随频率变化的规律[13]。

1.3.1.3 超声波处理糯米全粉的单因素试验

以糯米全粉凝胶在频率10 Hz下的tanδ为指标，研究超声波功率（130、160、200 W）、超声时间（5、10、20、30、40 min）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，m/V）对糯米全粉凝胶tanδ的影响。

1.3.1.4 超声波处理糯米全粉的正交试验

在单因素试验基础上进行L9(34)正交试验，研究超声波功率、超声波时间和料液比3个因素对凝胶tanδ的影响，确定超声波处理最佳工艺参数。正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.2 糯米淀粉的制备

参考周显青等[14]的方法并作修改，将糯米全粉加入0.34 g/100 mL NaOH溶液中反应4 h，然后3 000 r/min离心15 min；用1.0 mol/L HCl溶液中和至中性，以3 000 r/min离心15 min，去上清液，重复水洗3 次，将淀粉沉淀在45 ℃烘箱中干燥12 h后过80 目筛，得到糯米淀粉。

1.3.3 糊化特性分析

称取样品与蒸馏水混合制备成质量分数10%的乳液。采用快速黏度分析仪，参照GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性测定 快速粘度仪法》对样品糊化特性进行测定。设定程序如下：在50 ℃保持1 min，在4 min内匀速升温至95 ℃，保持3 min，然后在4 min内匀速降温至50 ℃，保持1 min。

1.3.4 凝胶特性分析

1.3.4.1 冻融稳定性

将样品与蒸馏水混合制备成质量分数6%的乳液于沸水浴中加热15 min，同时不停搅拌，完全糊化后，称取样品糊与离心管（50 mL）总质量，然后将离心管置于-18 ℃冰箱中冷冻24 h后，30 ℃水浴中解冻4 h，3 000 r/min离心30 min。若有水析出，将水倒去，称总质量，然后放入冰箱中再次冷冻。如此反复冷冻、解冻循环5 次。析水率按式（1）计算。

式中：m1表示离心管质量/g；m2表示离心管和糊的质量/g；m3表示解冻去水后离心管和糊的质量/g。

1.3.4.2 质构特性

采用P/25探头测定凝胶的质构特性。测前速率2 mm/s，测中与测后速率均为1 mm/s，压缩比50%，触发力5 g。

1.3.5 扫描电子显微镜观察样品形貌

在真空条件下对样品喷金处理，在加速电压15 kV条件下进行扫描，观察不同放大倍数下样品的形貌。

1.3.6 糯米蛋白质的制备

根据代钰等[15]的方法有所改进，将20 g糯米粉加入500 mL 0.05 mol/L NaOH溶液中并在磁力搅拌器下搅拌反应90 min，以3 000 r/min离心15 min，将上清液用1.0 mol/L HCl溶液调节pH值为4.6～4.8，再次3 000 r/min离心15 min，沉淀真空冷冻干燥12 h，研磨过80 目筛，得到糯米蛋白质。

1.3.7 糯米蛋白特性分析

1.3.7.1 傅里叶变换红外光谱分析

参考Chen Xiangyan等[16]的方法并作修改，将样品与溴化钾（质量比1∶100）在玛瑙研钵中研磨，压片后进行傅里叶变换红外光谱扫描，扫描范围400～4 000 cm-1。分析酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）的峰[17]。各子峰与二级结构对应关系为：1 610～1 640 cm-1为β-折叠；1 640～1 650 cm-1为无规卷曲；1 650～1 660 cm-1为α-螺旋；1 660～1 700 cm-1为β-转角。

1.3.7.2 游离巯基和二硫键含量测定

游离巯基含量测定：参考Pan Mengmeng等[18]的方法并作修改。称取100 mg样品，溶解于10 mL标准缓冲溶液（8 mol/L脲、86 mmol/L Tris、90 mmol/L甘氨酸，pH 8.0）中，3 000 r/min离心15min，得到上清液，用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质量浓度。向比色管中加入1 mL上清液、4 mL标准缓冲液，再加入0.04 mL DTNB，混合均匀后放入25 ℃恒温水浴锅中反应30 min，在412 nm波长处测定溶液吸光度。游离巯基含量按式（2）计算。

式中：73.53为摩尔消光系数/（L/（mol·cm））；A412nm为吸光度；n为稀释倍数；ρ为蛋白质量浓度/（mg/mL）。

总巯基含量：取1 mL蛋白质上清液加入0.1 mLβ-巯基乙醇和4 mL标准缓冲溶液，在30 ℃水浴中反应1 h，然后加入10 mL 12%三氯乙酸溶液混合均匀后4 000 r/min离心15 min，倒掉上清液，向沉淀中再加入5 mL 12%三氯乙酸溶液二次复溶，离心。将沉淀物溶于标准缓冲溶液，加入0.04 mL DTNB显色，于412 nm波长处测定吸光度。二硫键含量按式（3）计算。

1.3.7.3 热特性分析

用差示扫描量热仪测定糯米蛋白热特性。称取2.5 mg（干基）样品密封于铝盘中，测试条件：升温速率10 ℃/min，温度范围为30～200 ℃。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.5软件作图，利用SPSS Statistics 25软件进行方差分析，结果由平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。所有实验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 超声波处理糯米全粉的最佳工艺参数

2.1.1 单因素试验结果

料液比1∶2、超声时间10 min固定不变，超声波功率对糯米全粉凝胶tanδ的影响如图1A所示，糯米全粉凝胶的tanδ随超声波功率的增大而减小，在130 W时tanδ最大为0.80，tanδ下降即G’’与G’的比值下降，可能是超声波产生的空化作用削弱了淀粉颗粒与蛋白质之间的联结，使得蛋白质与淀粉之间形成的三维网络结构强度减弱[19]。随着超声波功率的增大，空化作用加强，凝胶体系的黏弹性下降，故选择超声波功率为130 W进行优化试验。

料液比1∶2、超声波功率130 W固定不变，超声时间对糯米全粉凝胶tanδ的影响如图1B所示，糯米全粉凝胶的tanδ随超声时间的延长先增大后减小，在10 min时达到最大值，为0.75。随着超声处理时间的延长，超声波的空化作用加强，对淀粉颗粒与蛋白质之间联结及作用力的破坏程度增强，导致凝胶体系黏弹性下降，故选择超声时间为10、20、30 min进行优化试验。

超声波功率130 W、超声时间5 min固定不变，料液比对糯米全粉凝胶tanδ的影响如图1C所示，随用水量增加至料液比为1∶10时tanδ最低，这可能是用水量增加到一定程度，料液翻动程度加剧，超声波产生的气流剪切作用加强，使得凝胶体系的黏弹性下降。tanδ在料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8时变化不大（约0.74），为减少用水量，故选择料液比为1∶2、1∶4、1∶6进行优化试验。

图1 单因素对糯米全粉凝胶tan δ的影响Fig. 1 Single factors of variables on tan δ of waxy rice flour gel

2.1.2 正交试验结果

由表2可知，各因素对糯米全粉凝胶的tanδ影响的主次顺序为A＞C＞B，考虑节省时间，确定最优组合为A1B2C1，即超声波功率130 W、超声时间20 min、料液比1∶2。在最优工艺条件下进行3 次重复验证实验，糯米全粉凝胶tanδ平均值为0.82。通过方差分析（表3）可知，超声波功率和料液比对糯米全粉凝胶的tanδ有极显著影响，而超声时间对其有显著影响。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance for the effect of variables on tan δ of waxy rice flour gel and significance test

2.2 超声波处理对糯米全粉特性的影响

2.2.1 糯米全粉的微观结构

由图2A可知，原糯米全粉（waxy rice flour，WRF）淀粉颗粒在蛋白质基质作用下发生团聚，形成直径为30～70 μm的聚集体。由图2B可知，UT-WRF淀粉颗粒分散分布，蛋白质基质呈片状散落，仍有少数淀粉颗粒聚集，淀粉颗粒完整独立，呈现出典型糯米淀粉颗粒的多角形态，粒径为3～8 μm[15]。

图2 糯米全粉扫描电子显微镜图Fig. 2 Scanning electron micrographs of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour

2.2.2 糯米全粉的糊化特性

由表4可知，与WRF相比，UT-WRF的糊化温度无显著性变化，UT-WRF的峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、崩解值和回生值均显著升高（P＜0.05），这可能是因为WRF经过超声波处理后，蛋白质与淀粉颗粒之间的结合变得松散，有利于水分子进入，增加了淀粉颗粒与水分子接触，使得淀粉在糊化过程中充分吸水膨胀，易于糊化并能够完全糊化[20]。

表4 糯米全粉的糊化特性Table 4 Pasting properties of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour

2.2.3 超声波处理对糯米全粉凝胶特性的影响

2.2.3.1 糯米全粉凝胶的冻融稳定性

析水率表示糯米全粉凝胶的冻融稳定性，析水率低表示冻融稳定性较好。由图3可知，WRF凝胶与UT-WRF凝胶的析水率均随着冻融循环次数的增加而逐渐增大，但在同一冻融循环次数下WRF凝胶与UT-WRF凝胶的析水率无显著差异（P＞0.05），表明超声波处理对糯米全粉形成凝胶的冻融稳定性没有显著影响。

图3 糯米全粉凝胶析水率Fig. 3 Syneresis rates of raw and ultrasonic-treated waxy rice flour gels after repeated freeze-thaw cycles

2.2.3.2 糯米全粉凝胶的流变学性质

由图4可知，UT-WRF凝胶的G’和G’’均小于WRF凝胶，UT-WRF凝胶G’与WRF凝胶G’’较为接近；UT-WRF凝胶G’与G’’差值小于WRF凝胶。Zhan Qian等[21]发现去除所有淀粉颗粒相关蛋白后，糯米全粉凝胶的G’和G’’均下降。由图5可知，WRF凝胶与UT-WRF凝胶的tanδ均小于1，UT-WRF凝胶的tanδ大于WRF凝胶，两种凝胶tanδ的差值约为0.14，这说明经过超声处理后糯米全粉凝胶体系的弹性下降、黏性增强，凝胶性变弱。

图4 糯米全粉凝胶的动态模量曲线Fig. 4 Dynamic modulus curves of waxy rice flour gels

图5 糯米全粉凝胶的黏弹性流变曲线Fig. 5 Viscoelastic rheological curves of waxy rice flour gels

2.2.3.3 糯米全粉凝胶的质构性质

由表5可知，与WRF凝胶相比，UT-WRF凝胶的硬度、回复力、弹性和胶着性均显著下降，而黏附性显著增大（P＜0.05），说明经超声波处理后糯米全粉的凝胶强度显著下降，糯米全粉凝胶趋于呈现软凝胶性质。

表5 糯米全粉凝胶的质构特性Table 5 Texture parameters of waxy rice flour gels

2.3 超声波处理对糯米全粉凝胶特性的影响机制

2.3.1 超声波处理对糯米淀粉特性的影响

2.3.1.1 糯米淀粉的微观结构

如图6A所示，从WRF中提取的淀粉（starch isolated from waxy rice flour，S-WRF）颗粒较小，颗粒直径为3～8 μm，颗粒表面光滑，多数呈棱角分明的多角状[15]，如图6B所示，从UT-WRF中提取的淀粉（starch isolated from ultrasound treated waxy rice flour，S-UT-WRF）颗粒形貌、大小与S-WRF相比均无明显变化，且颗粒结构完整，说明超声波处理并没有对糯米淀粉颗粒的形貌结构产生破坏。

图6 糯米淀粉扫描电子显微镜图Fig. 6 Scanning electron micrograph of waxy rice starch

2.3.1.2 糯米淀粉的糊化特性

由表6可知，S-WRF和S-UT-WRF的糊化温度、谷值黏度、最终黏度均无显著差异（P＞0.05），S-UTWRF的峰值黏度、崩解值与回生值均较S-WRF显著增大（P＜0.05），说明超声波处理糯米全粉时对淀粉的吸水溶胀特性有一定影响。

表6 糯米淀粉的糊化特性Table 6 Pasting properties of waxy rice starch

2.3.1.3 超声波处理对糯米淀粉凝胶特性的影响

由图7可知，S-WRF与S-UT-WRF的析水率均随冻融循环次数的增加而增大（P＜0.05），但相同冻融循环次数下S-WRF与S-UT-WRF的析水率无显著差异（P＞0.05），说明S-WRF与S-UT-WRF的冻融稳定性无显著差异。结合图3可知，糯米全粉的析水率高于糯米淀粉，说明糯米淀粉凝胶的冻融稳定性比糯米全粉凝胶好，可能是由于冷冻处理对糯米全粉中蛋白质的形态结构影响较大，在冻融循环过程中蛋白质不能恢复到原来的状态而失去持水性，造成糯米全粉凝胶的冻融稳定性比糯米淀粉差[22]。

图7 糯米淀粉的析水率Fig. 7 Syneresis rate of waxy rice starch

由图8可知，S-UT-WRF凝胶与S-WRF凝胶的G’和G’’均无明显差异，糯米淀粉凝胶的G’和G’’与UT-WRF凝胶接近，说明糯米全粉经过超声波处理后其凝胶特性趋向于糯米淀粉的凝胶特性。由图9可知，S-UT-WRF凝胶的tanδ大于S-WRF凝胶，但差值很小，约为0.04，说明超声波处理对糯米淀粉凝胶的弹性和黏性影响很小。

图8 糯米淀粉凝胶的动态模量曲线Fig. 8 Dynamic modulus curve of waxy rice starch gel

图9 糯米淀粉凝胶的黏弹性流变曲线Fig. 9 Viscoelastic rheological curve of waxy rice starch gel

由表7可知，S-WRF凝胶与S-UT-WRF凝胶的硬度、黏附性、回复力、内聚性、弹性和胶着性均无显著差异（P＞0.05），说明在超声波处理糯米全粉过程中，并没有对糯米淀粉产生破坏。结合表5分析可知，糯米全粉凝胶的硬度、回复力、弹性均大于糯米淀粉凝胶，说明糯米全粉中的蛋白质能够增强凝胶强度[23]。

表7 糯米淀粉凝胶的质构特性Table 7 Texture parameters of waxy rice starch gel

2.3.2 超声波处理对糯米蛋白质特性的影响

2.3.2.1 糯米蛋白质的微观结构

由图10可知，从WRF中提取的蛋白质（protein extracted from waxy rice flour，P-WRF）呈致密块状结构，从UT-WRF中提取的蛋白质（protein extracted from ultrasound treated waxy rice flour，P-UT-WRF）结构松散，孔洞密集。这可能是由于超声波的空化效应产生了局部超高压和高频振动[24]，改变了蛋白质的高级构象，使蛋白质结构变得松散。

图10 糯米蛋白扫描电子显微镜图Fig. 10 Scanning electron micrograph of waxy rice protein

2.3.2.2 糯米蛋白质的二级结构

将糯米蛋白的酰胺I带图谱作二阶导数并同时进行高斯拟合（图11），计算各二级结构对应子峰积分面积，得到二级结构相对含量。由表8可知，P-UT-WRF二级结构中β-折叠与无规卷曲相对含量显著上升（P＜0.05），而α-螺旋与β-转角相对含量则显著下降（P＜0.05），说明超声波处理破坏了蛋白质分子间的相互作用并影响了蛋白质分子结构[25]。

图11 傅里叶变换红外光谱分析糯米蛋白质二级结构Fig. 11 FT-IR spectra and fitting of amide I bands of waxy rice protein

表8 糯米蛋白质的二级结构相对含量Table 8 Secondary structure content of waxy rice protein%

2.3.2.3 糯米蛋白质的二硫键含量

由表9可知，与P-WRF相比，P-UT-WRF的游离巯基含量显著上升（P＜0.05），二硫键含量显著下降（P＜0.05）。这是由于超声波的空化作用使蛋白质分子间或分子内的二硫键断裂[26]，二硫键断裂后形成新的游离巯基[27]。二硫键含量下降会导致糯米蛋白质的刚性减弱[28]。

表9 糯米蛋白质的游离巯基与二硫键含量Table 9 Free sulfhydryl and disulfide bond contents of waxy rice protein

2.3.2.4 糯米蛋白质的热特性

蛋白质分子的热稳定性可通过热变性温度（Td）与焓变（ΔH）反映，Td与ΔH越小，蛋白质有序程度越低、结构越不稳定，使其完全变性需要的能量就越小[29]。如表10所示，P-WRF的Td为165.31 ℃、ΔH为138.47 J/g，P-UT-WRF的Td为147.56 ℃、ΔH为123.63 J/g，表明P-UT-WR的热稳定性显著下降。

表10 糯米蛋白质的热力学特性Table 10 Thermodynamic properties of waxy rice protein

糯米全粉的凝胶特性由其中组分的含量、结构、特性及其相互作用决定。已有报道指出糯米全粉中蛋白质含量对糯米全粉及其制品的凝胶特性有显著影响[13,30-32]。本研究结果表明，应用超声波处理不改变其中淀粉的结构和特性，也不改变糯米全粉中蛋白质含量，而是通过改变蛋白质的构象而改变淀粉和蛋白质的相互作用，从而改变糯米全粉的凝胶特性。

3 结 论

通过单因素和正交试验可知，在超声波功率130 W、料液比1∶2，超声时间20 min条件下制备的UT-WRF凝胶tanδ最高，为0.82。经超声波处理后，糯米全粉凝胶的黏性显著提高，表现出较好的软凝胶特性。分析经超声波处理的糯米全粉中两大组分淀粉和蛋白质特性发现，超声波处理改变了糯米全粉中蛋白质的形态和分子结构，使蛋白质发生解聚，蛋白质基质结构变得松散；超声波处理对糯米全粉中淀粉的颗粒结构和特性未产生显著影响，表明超声波处理糯米全粉时，主要是通过改变其中蛋白质的构象而改变全粉的凝胶特性。