MS-222麻醉剂在珍珠龙胆石斑鱼体内残留消除规律的研究

尤 扬，黄 和，黄伊彤，陈彩燕，李钰娟，黄锦娴

（广东海洋大学 食品科技学院，广东湛江 524088）

珍珠龙胆石斑鱼作为常见水产品之一，在运输过程中常由于应激反应过强使其受到损伤甚至死亡，造成经济损失，因此在石斑鱼的长途运输过程中，商家会对其使用渔用麻醉剂。在实际运输中，需要建立既可以在短时间内麻醉石斑鱼又保证其复苏后存活率的有效麻醉浓度，保证长时间运输的高存活率[1]。渔用麻醉剂被广泛应用于水产动物的捕捉、运输、取样等经济生产和科学研究，能够有效地降低水产动物的应激反应，可提高水产动物的存活率[2]。MS-222 是目前世界范围内广泛使用的渔用麻醉剂[3]。适量的MS-222 能抑制鱼的反射和活动能力，使鱼呼吸减慢、行动迟缓，达到减少代谢及耗氧的目的，从而进入休眠状态，适用于长途运输[4]。

不同类型水产品的麻醉效果和代谢MS-222 的速度不同，导致消除期各异[5]。但是，针对MS-222麻醉剂在鱼类中的残留与消除规律的研究较少，目前尚未有石斑鱼中MS-222 残留代谢规律的研究报道。因此，本试验利用MS-222 麻醉剂对石斑鱼进行保活麻醉试验，用气相色谱-质谱法检测石斑鱼中MS-222 麻醉剂残留量，探讨MS-222 麻醉剂在石斑鱼不同部位残留消除规律，为保障MS-222 麻醉剂使用的安全性和政府制定MS-222 在水产品中残留限量标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

MS-222，纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯、分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸镁，国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺固相吸附剂（Primary Secondary Amine Sorbent，PSA），上海麦克林生化科技有限公司；十八烷基吸附剂（Octadecyl C18Sorbent，C18ODS），国药集团化学试剂有限公司；石墨化碳黑，国药集团化学试剂有限公司；0.22 μm 微孔有机滤膜，国药集团化学试剂有限公司。

凝胶色谱-气质联用仪（岛津，日本）；高速冷冻台式离心机（赛默飞，美国）；全自动平行氮吹仪（睿科，中国）。

1.2 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：DB-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：起始温度100 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1升到200 ℃，保持2 min，再以25 ℃·min-1升到终止温度275 ℃，保持5 min；流速：1.2 mL·min-1；进样口温度：280 ℃，不分流进样；离子源温度：270 ℃。

（2）质谱条件。离子源温度：270 ℃；溶剂延迟：3 min；采集方式：选择离子监测（SIM）模式；MS-222 的定性离子碎片：92m/z、120m/z、137m/z、165m/z，其中120m/z为定量离子，各离子丰度比（%）为81∶100∶37∶72。

1.3 试验方法

1.3.1 有效麻醉浓度选择试验

为模拟运输情况和复苏后的存活情况，将MS-222 标准品加入水箱中稀释成浓度为80 mg·L-1、120 mg·L-1、200 mg·L-1和300 mg·L-1的30 L 麻醉药液。每个浓度设置5 尾石斑鱼，在充气补氧的条件下将石斑鱼麻醉24 h，捞出冲洗表面后放入水箱中复苏，计算存活率，根据结果确定适合长时间麻醉的MS-222 浓度。

1.3.2 石斑鱼中MS-222 残留试验

为研究MS-222 在石斑鱼肌肉和肝脏中的残留情况，根据1.3.1 中确定的有效浓度，于水箱中配制浓度为120 mg·L-1的MS-222 麻醉药液30 L，在水箱中放入9 尾石斑鱼，每隔3 h 随机取出1 尾石斑鱼，共计24 h。取样时用洁净海水冲洗石斑鱼表面残留的药液，避免影响试验结果。将石斑鱼去皮，取出肌肉和肝脏，分别进行均质处理。将所取得的样品于-20 ℃冻藏，等待样品处理提取MS-222，使用气相色谱串联质谱仪测定MS-222 含量。

1.3.3 石斑鱼中MS-222 消除试验

进行MS-222 残留试验后，测定石斑鱼在120 mg·L-1的MS-222 麻醉药液中浸浴24 h 后的消除情况。于配制的30 L 麻醉药液水箱中放入9 尾石斑鱼，将石斑鱼在MS-222 麻醉液中药浴24 h 后，将所有石斑鱼放入清洁海水中进行消除试验，不断充气。在复苏过程中分别在0 h、2 h、5 h、10 h、16 h、24 h、36 h、48 h 和72 h 这9 个时间点随机选取1 尾石斑鱼，将石斑鱼去皮，取出肌肉和肝脏，分别进行均质处理。将所取得的样品于-20 ℃冻藏，等待样品处理提取MS-222，使用气相色谱质谱仪测定MS-222 含量。

1.3.4 样品处理

将冷藏的肝脏和肌肉样品自然解冻，称量2.0 g左右的样品（已均质的石斑鱼肌肉/肝脏）于50 mL离心管中，加入2 mL 蒸馏水，旋涡1 min。加入10 mL 乙腈，涡旋3 min 后，超声萃取10 min。在50 mL 离心管中加入1.5 g 氯化钠，手摇混匀，再加入2 g 无水硫酸镁，手摇混匀，4 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液并全部转移至另一装有300 mg 无水硫酸镁+100 mg PSA+100 mg C18+20 mg 石墨化碳黑的15 mL 离心管中，手摇混匀，4 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液至氮吹管中，氮吹至管壁湿润近干。用2 mL 乙酸乙酯复溶，充分溶解后吸取浓缩液，0.22 μm 微孔有机滤膜过滤入进样小瓶，后上机检测。

1.3.5 数据统计分析

试验所得数据通过Excel 整理并绘图分析。

2 结果与分析

2.1 有效麻醉浓度选择结果及分析

对于鱼类的麻醉时期，不同学者对其有不同的分期。本试验将石斑鱼在实际麻醉试验中的呼吸频率及幅度、平衡性、尾鳍动作等行为特征作为麻醉分期的标准，并结合其他文献中对鱼类麻醉的分期方法，将MS-222 对石斑鱼的麻醉过程分为5 个阶段：轻度镇静期（麻醉1 期）、深度镇静期（麻醉2 期）、轻度麻醉期（麻醉3 期）、深度麻醉期（麻醉4 期）以及延髓麻醉期（麻醉5 期）。

于试验设定的4 个浓度麻醉药液中各放入5 条石斑鱼，浸浴24 h 后，放入30 L 洁净海水箱中复苏，若石斑鱼复苏1 h 后仍然不能恢复呼吸即认定为死亡，若不能回到正常游动状态只能侧身游动即认定为瘫痪。石斑鱼在不同MS-222 浓度下浸浴24 h 后的成活率见表1。

表1 石斑鱼在不同MS-222 浓度下浸浴24 h 后的成活率表

由表1可知，当麻醉药液浓度为200 mg·L-1和300 mg·L-1时，石斑鱼全部僵直死亡。麻醉药液浓度为80 mg·L-1的石斑鱼，由于适应环境及代谢作用，长时间麻醉后恢复到麻醉1 期。石斑鱼游动时会互相伤害甚至死亡，不适用于实际运输。麻醉药液浓度为120 mg·L-1时，石斑鱼可长时间维持于麻醉4 期，此状态下可实现高密度且长时间运输。综上所述，MS-222 对石斑鱼的有效麻醉浓度确定为120 mg·L-1。

2.2 石斑鱼中MS-222 残留试验结果及分析

用浓度为120 mg·L-1的MS-222 进行麻醉残留试验，按照1.3.2 中所确定的时间点采集石斑鱼样品，分别取肌肉和肝脏进行匀浆处理。采用气相色谱-质谱法测定麻醉石斑鱼肌肉和肝脏中MS-222 的残留量，结果见图1。

图1 石斑鱼肌肉和肝脏中MS-222 的残留情况图

随着麻醉时间的延长，MS-222 在石斑鱼肝脏和肌肉中含量呈快速上升又逐渐下降，后有轻微上升的趋势，最后基本稳定。其中在石斑鱼肌肉中，前9 h 的残留量呈直线上升，在9～21 h 肌肉中MS-222 含量逐渐下降，但在21～24 h 残留量又小幅度上升，最大残留浓度为55.68 mg·kg-1。在石斑鱼肝脏中，前9 h 的残留量增长迅速，在9～18 h 肝脏中MS-222 含量逐渐下降，但在18～24 h 间残留量又再上升，最大残留浓度为93.39 mg·kg-1。可见石斑鱼肝脏中的MS-222 残留量大于肌肉，肝脏和肌肉残留曲线趋势大致类似。第24 h 的肌肉中MS-222 残留浓度为18.73 mg·kg-1，肝脏中MS-222 残留浓度为28.43 mg·kg-1。

2.3 石斑鱼中MS-222 消除试验结果及分析

将石斑鱼在120 mg·L-1的MS-222 麻醉药液中药浴24 h 后，将所有石斑鱼放入洁净海水中进行消除试验，在消除过程中不断充气，于不同时间点随机选取1 尾石斑鱼进行MS-222 浓度的测定。72 h 内MS-222 在石斑鱼不同部位残留量见图2。

图2 石斑鱼肌肉和肝脏中MS-222 的消除情况图

随着消除时间的延长，MS-222 在石斑鱼肌肉和肝脏中的浓度在10 h内呈先升高后逐渐降低的趋势。在前2 h 内，肌肉残留量出现小幅度升高，最高残留浓度为20.56 mg·kg-1。而肝脏在前5 h 内，出现大幅度的重吸收现象，最高残留浓度达到66.40 mg·kg-1。在石斑鱼肌肉MS-222 消除试验中，消除时间为24 h时的MS-222 残留浓度为2.08 mg·kg-1，而消除时间为48 h 时MS-222 残留量低于检测限；在肝脏中，5～10 h 内MS-222 的消除速度极快，消除时间为48 h 时MS-222 残留浓度为0.05 mg·kg-1，而消除时间为72 h 时MS-222 残留量低于检测限。石斑鱼肝脏与肌肉的MS-222 消除曲线相似，其中肌肉在48 h时MS-222 残留量降低到检测限以下，即完全消除，而肝脏在48 h 时MS-222 残留量极小，在72 h 时MS-222 残留量降低到检测限以下，即完全消除。

3 结论

通过MS-222 有效麻醉浓度选择试验和分析石斑鱼麻醉后样品中MS-222 残留量，得出以下结论。

（1）通过24 h 麻醉及复苏试验，对比4 个浓度MS-222 麻醉药液浸泡石斑鱼的成活率和瘫痪率，得出MS-222 有效麻醉浓度为120 mg·L-1。

（2）将石斑鱼在浓度为120 mg·L-1的MS-222 麻醉药液中进行24 h 的药浴处理，MS-222 在石斑鱼不同组织中残留有差异，肌肉中的最高残留浓度可达到55.68 mg·kg-1，而在肝脏中的残留量比肌肉高，最高残留浓度可达到93.39 mg·kg-1。在MS-222 浓度为120 mg·L-1的消除试验中，MS-222 在石斑鱼肝脏中完全消除时间比肌肉长，肌肉需要48 h，肝脏为72 h。