LC-MS/MS法测定火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因含量的不确定度评定

刘应琪，杨延康，伏 华，胡 艳，谢凤梅，靳泽荣*

（1.四川敏恩检测技术有限公司，四川成都 610000；2.成都圣恩生物科技股份有限公司，四川成都 610000）

火锅作为中国传统美食，在我国的历史源远流长。火锅因其麻辣鲜香的特点给人们以独特的味觉享受，再加上吃火锅的过程本身带有一定的社交属性，备受人们喜爱，同时麻辣火锅底料产品的出现也推动了麻辣火锅的发展，使火锅行业呈现一片欣欣向荣的景象[1-3]。火锅底料是以动物油（如牛油、羊油）或植物油（如菜籽油、大豆油、玉米油）、辣椒、豆瓣、花椒、姜和蒜等为主要原料，经炒制而形成的一种复合调味料[4]。

吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁等为生物碱类物质，人体食用后会产生强烈的依赖性，危害身心健康[5-11]。2008年12月原卫生部发出《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》，明确将其列为非法添加物，且标注其可能被添加的食品为火锅、火锅底料等[12]。

测量不确定度是指根据用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数[13]。检验检测实验室应对数据的准确性予以把控，且有能力对测量结果进行不确定度评估；当检测方法有规定或检测结果接近限值要求时，检测报告须提供测量结果的不确定度[14-21]。目前，测定吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁等生物碱类物质的方法有多种[22-24]，本文采用液相色谱-串联质谱法进行检测，依据《测量不确定度要求的实施指南》（CNAS—GL05:2011）[25]及《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06:2006）[26]，建立不确定度评估模型，识别测定过程中不确定度来源，评估各不确定度分量并合成得到标准不确定度和扩展不确定度。

1 材料与方法

1.1 仪器

液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪，1290-6460，安捷伦科技有限公司；电子天平（感量为0.000 1 g），ME204E，梅特勒-托利多公司；电子天平（感量为0.000 01 g），MS105，梅特勒-托利多公司；离心机，HR/T20MM，湖南赫西仪器装备有限公司；超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；涡旋混合器，XW-80A，上海精科实业有限公司。

1.2 试剂与材料

火锅底料：市售；吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因标准溶液：批号21081223，坛墨质检；甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，Fisher；盐酸、甲酸铵、氢氧化钠、无水醋酸钠和无水硫酸钠：分析纯，成都科隆化工有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）填料：粒度40～70 μm；C18填料：粒度40～50 μm。

1.3 试验方法

参照《食品安全地方标准 火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法》（DB 31/2010—2012）测定。

1.3.1 标准溶液的配制

精密吸取混合标准溶液适量，用乙腈稀释成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度分别为1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，吗啡、可待因浓度分别为5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的系列标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 样品前处理方法

准确称取2 g 样品于50 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，加入150 µL 同位素内标工作液，再加入10 mL 水，振摇使分散均匀，加入15 mL 乙腈，涡旋振荡1 min，加入6 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水醋酸钠的混合粉末，迅速振摇，涡旋振荡1 min，以4 000 r·min-1离心5 min，取上清液待净化。

称取（50±5）mg PSA，（100±5）mg 无水硫酸镁，（100±5）mg C18粉末置于2 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，移取1.5 mL 上清液至此离心管中，涡旋混合1 min，以10 000 r·min-1离心2 min，移取上清液，0.22 μm 滤膜过滤，取滤液待测。

1.3.3 液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪条件

色谱柱：BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），或相当者；进样量：5 μL；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；流动相：A 相为含0.1%甲酸的乙腈，B 相为含0.1%甲酸的10 mmol·L-1甲酸铵溶液。

1.4 测量模型

火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因含量测定的计算公式为

式中：X为试样中各待测物的含量，μg·kg-1；c为从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，µg·L-1；V为样液的提取体积，mL；m为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源的识别

根据实验方法及建立的测量模型，识别其引入的不确定度主要有样品的精密度产生的不确定度、通过回收率表示的准确性产生的不确定度、标准曲线拟合产生的不确定度、标准品引入的不确定度、定容体积引入的不确定度及样品质量引入的不确定度（表1）。

表1 各不确定度分量的类型及概率分布

通过将以上识别出的各不确定度分量进行评定，得出各分量的标准不确定度及相对标准不确定度，并进行合成。在95%的置信水平下，计算扩展不确定度，最终得到测定火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因含量的不确定度。

2.2 各分量的不确定度评定

2.2.1 精密度引入的相对标准不确定度评定

样品的测量过程受样品均匀性、操作人员的技术能力、设备的分辨率和稳定性以及试剂耗材的质量水平等因素影响。通过实验过程的多次重复，评定其精密度的相对标准不确定度，可综合体现样品均匀性、人员操作技能等多种因素的随机影响。按照试验方法，对样品重复测定6 次，通过A 类评定的方式评定样品测试的精密度引入的相对标准不确定度，计算公式为

表2 样品重复测定结果

2.2.2 准确度引入的相对标准不确定度评定

样品检测结果的准确度可通过在样品中加标得到的回收率来体现。分别对每个物质进行3 个浓度水平的添加，每个浓度水平分别重复2 次，计算加标回收率，通过A 类评定的方式评定样品测试的准确度所引入的相对标准不确定度，计算公式为

测定结果如表3所示。

表3 样品回收率测定值

2.2.3 最小二乘法拟合标准曲线求样品质量浓度引入的相对标准不确定度评定

（1）标准溶液峰面积残差的标准差。采用5 个不同浓度水平点绘制标准曲线，将每个浓度点分别测定2 次，得到相应的峰面积，并用最小二乘法拟合求出一元回归方程，标准溶液峰面积残差标准差的计算公式为

测定结果如表4所示。

（2）使用拟合标准曲线求得样品质量浓度过程中所引入的不确定度。按照试验方法，对样品进行重复测定6 次，测得样品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的含量见表2，则按下列公式计算标准曲线拟合的相对标准不确定度，计算结果见表4。

表4 标准曲线测定结果

2.2.4 标准物质配制引入的相对标准不确定度评定

就是说，在教室里，在大庭广众之下，学生们都会受到群体氛围的影响，这会使学生的言行举止变得似乎更加可气可恼。

（1）标准物质的相对标准不确定度。由标准物质证书可知，本实验所用标准物质的不确定度见表5，按照B 类评定方法、均匀分布模式，其相对标准不确定度见表5。

表5 标准物质的相对标准不确定度

（2）标准工作溶液配制过程中引入的相对标准不确定度。标准工作溶液配制过程中所用量器引入的不确定度：本实验采用10 mL 容量瓶配制标准溶液，根据国家标准《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定，其允许误差为±0.02 mL，按三角分布计算，其相对标准不确定度为

标准工作溶液配制过程中温度变化引入的不确定度：假设标准溶液温度与检定标准温度（20 ℃）温差为5 ℃，水在20 ℃的膨胀系数为0.000 21 ℃-1，则不确定分量为

（3）标准工作溶液配制过程中引入的相对标准不确定度按下式计算，结果见表5。

2.2.5 样品处理过程中所用量器造成体积引入的相对标准不确定度评定

样品处理过程中所用量器造成体积的不确定度主要来源为量器的准确性及温度变化两个方面。量器的准确性引起的标准不确定度分量ur,a(V)，可根据国家标准《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定容量允差按三角分布计算，实际操作过程中溶液温度与检定标准温度（20 ℃）不同引起的相对标准不确定度ur,b(V)，已知水的膨胀系数为0.000 21 ℃-1，按均匀分布求得，结果见表6。

表6 体积引起的相对不确定度

2.2.6 样品称量过程引入的相对标准不确定度评定

根据电子天平的使用说明书及检定证书，当称样量≤50 mg 时，天平的最大允许误差为±0.5 mg，称取样品量为2 g，天平分辨率为0.1 mg，按照B 类评定均匀分布方法，则样品称量过程中引入的相对标准不确定度为

2.3 相对标准不确定度的合成

将上述各不确定度分量进行合成，则吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的合成相对标准不确定度分别为

2.4 相对扩展不确定度评定

取置信概率为95%，k=2，则吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的相对扩展不确定度分别为

Urel1=k×urel(Y1)=2×0.043 80=0.087 60

Urel2=k×urel(Y2)=2×0.032 98=0.065 96

Urel3=k×urel(Y3)=2×0.041 38=0.082 76

Urel4=k×urel(Y4)=2×0.044 28=0.088 55

Urel5=k×urel(Y5)=2×0.042 35=0.084 70

2.5 扩展不确定度

由实验数据可知，样品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的含量分别为74.919 7 μg·kg-1、74.545 0 μg·kg-1、14.993 1 μg·kg-1、15.679 4 μg·kg-1、15.466 8 μg·kg-1，其扩展不确定度为

吗啡：U1=74.919 7×0.087 60=6.563 0 μg·kg-1

可待因：U2=74.545 0×0.065 96=4.916 9 μg·kg-1

罂粟碱：U3=14.993 1×0.082 76=1.240 8 μg·kg-1

那可丁：U4=15.679 4×0.088 55=1.388 5 μg·kg-1

蒂巴因：U5=15.466 8×0.084 70=1.310 1 μg·kg-1

2.6 结果表示

根据不确定度的评估，火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定结果分别为X1=（74.919 7±6.563 0）μg·kg-1，k=2；X2=（74.545 0±4.916 9）μg·kg-1，k=2；X3=（14.993 1±1.240 8）μg·kg-1，k=2；X4=（15.679 4±1.388 5）μg·kg-1，k=2；X5=（15.466 8±1.310 1）μg·kg-1，k=2。

3 结论

LC-MS/MS法测定火锅底料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因含量测量不确定度评定结果见图1。结果显示，对吗啡而言，准确度引入的不确定度贡献最大，对可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因而言，标准曲线拟合及标准曲线配制过程引入的不确定度贡献最大，样品称量过程引入的不确定度对总的不确定度贡献最小。因此，在日常检测过程中，检测人员应注意选购质量稳定、准确度等级较高的标准品，加强标准工作液配制过程操作的规范性，同时使用经过计量检定的合格器皿。从检测的各个方面加强质量管控，降低各不确定度分量，提高结果准确度和有效性。

图1 测量不确定度分量示意图