高效液相色谱法检测奶粉中香兰素的含量

王存孝

（南京科技职业学院，江苏南京 210048）

香料是日常食品中一类可以改变食品味道的物质，如香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）就是目前市场上重要的香料之一，它具有浓郁的奶香气息，能起到增香、抑菌和抗氧作用[1]，被广泛用于食品特别是乳制品中。香兰素的过量使用会对人体产生危害，导致恶心、呕吐和头痛等症状，严重时甚至会损伤肝肾功能[2]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2790—2014）规定了香兰素在食品中的使用限量[3]，而现在许多乳品企业为了满足消费者口味，在奶粉中过量使用香兰素和香精等添加剂，危害到消费者尤其是儿童的健康。

较为常见的香兰素的检测方法有色谱法、光谱法和电化学方法等[3]。采用紫外-可见分光光度法测定香兰素，操作简便、分析成本低、结果可靠，然而灵敏度较低，易受其他组分的谱线干扰[4]。电化学方法响应迅速、灵敏度高，但样品基质干扰严重，存在重复性差的问题。气相色谱法在检测时，由于前处理时间长、预处理复杂，易使香兰素氧化变质，不适用于现场快速检测。液相色谱-质谱法仪器昂贵，检测成本高，对环境和人的要求也高，在基层检验机构中推广困难[5]。高效液相色谱法则因其精密度、灵敏度高，操作相对简单快速而被广泛地应用。本文旨在采用高效液相色谱法建立一种针对市售常见奶粉中香兰素的快速检测的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Waters 2695 色谱仪；HY-2 漩涡振荡器（上海雷磁有限公司）；JP-3 超声波清洗器（上海继谱有限公司）；TG16 离心机（湖南湘仪）；0.45 μm 微孔滤膜。

1.1.2 试剂

香兰素标准溶液（≥98%）(上海麦克林生化科技有限公司)；甲醇（色谱级）；乙醇（AR）；奶粉样品（6 份，1～3 号为普通奶粉，4～6 号为幼儿奶粉）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

标准储备溶液（5 mg·mL-1）：称取1.25 g（准确到0.000 1 g）香兰素到250 mL 容量瓶中，使用乙醇溶解并定容摇匀，4 ℃避光保存。

标准中间溶液（100 μg·mL-1）：从标准储备溶液中移取2.00 mL 至100 mL 容量瓶中，使用乙醇稀释至刻度线，4 ℃避光保存。

标准工作溶液：移取一系列适量的100 μg·mL-1溶液，使用相同的稀释方法配制成含有0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1香兰素的标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

奶粉试样搅拌均匀后，准确称取2 g 于试管中，加入25 mL 的常温水，超声振动10 min，混匀并溶解，再将其旋涡振荡40 s。

移取以上试样溶液10.00 mL 于离心管中，加入10 mL 乙醇，涡旋混合40 s，然后高速离心8 min，用滴管将上层清液收集于容量瓶（50 mL）中。继续往离心管中加入同样体积的乙醇，重复此步骤操作2 次，每次都收集上层清液于同一个容量瓶中，将容量瓶定容至刻度线，摇匀，通过0.45 μm 微孔膜过滤，得到待测溶液。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：279 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

通过对标准液进行200～380 nm 的光谱扫描（图1）可以发现，香兰素的吸收峰有233 nm、279 nm 和308 nm 这3 处。233 nm 处峰型和灵敏度虽然较好，但易出现其他有机化合物的吸收峰干扰。选择279 nm和308 nm 为检测波长对香兰素标准工作液测定发现，相对于308 nm 波长，279 nm 处目标峰峰形对称性更好，信噪比更高。因此，选择279 nm 作为检测波长。

图1 香兰素的吸收光谱图

2.2 前处理条件优化

以1 号奶粉样品为基准，通过测定香兰素加标回收率的方法，考察提取剂对提取效率的影响。试验结果表明，传统的盐酸和乙腈溶液虽然能沉淀完全蛋白质，去除脂肪干扰，但提取效率较低，回收率不到85%。当选择乙醇作为提取剂后，提取效率提高10%以上。因此，本次实验将采用乙醇来提取样品中的香兰素。

实验发现，乙醇的用量较少时（≤10 mL）时，样品上层清液中会有蛋白和脂肪残留，出现浑浊现象，而当使用量增加至20 mL、30 mL、40 mL 时，提取率随之升高。考虑到30 mL和40 mL的提取效果接近，确定最终提取剂用量为30 mL。同时试验发现，提取剂采用多次提取的方式效率更高，但当提取次数为3次以上时，效率反而转低，可能是步骤和时间的增加导致待测物损失。因此，确定乙醇提取次数为3 次，每次10 mL。

涡旋混合时间过长会出现乳化现象，过短会导致提取率下降，混合时间在30～60 s 时，提取率比较稳定。从节约处理时间的角度出发，选择涡旋时间为30 s。

2.3 流动相的选择

以甲醇水溶液（30%～40%）为流动相时，在分离度和灵敏度方面都能满足测定需要。在样品测定中发现，甲醇溶液的浓度对香兰素的分离度影响不大，但会改变其出峰的时间。当甲醇浓度为30%时，待测组分和其他干扰组分即可实现良好的分离。因此，从成本和环保角度考虑，选择30%的甲醇水溶液为流动相。

2.4 线性范围和检出限

对香兰素标准工作溶液进行测定，绘制标准曲线，可得到图2。在0.1～40.0 μg·mL-1，峰面积与浓度拥有良好的线性关系，其线性方程为y=79.398x+12.764，r2=0.999 7，检出限（3S/N）为0.05 μg·mL-1。

图2 香兰素的标准曲线图

2.5 回收率及精密度实验

称取1 号乳粉样品20 份，每份2 g，按表1方法添加标样，进行回收率实验（n=5）。结果显示，加标回收率为96.0%～100.2%，相对标准偏差小于5%。

表1 奶粉中香兰素测定的回收率和RSD 表

2.6 实际样品测定

对6 种样品进行了香兰素含量测定，平行测定5次，结果如表2所示。1～3 号普通奶粉能检测出微量香兰素，在幼儿奶粉中未测出香兰素的存在，以上奶粉符合《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》要求。

表2 奶粉中香兰素的检测结果（n=5）

3 结论

香兰素在空气中易氧化和遇光分解的特性会给检测带来一定难度[6]。本研究结合香兰素回收率试验，优化了样品提取条件，并以甲醇水溶液为流动相，建立了一种高效液相色谱法测定奶粉中香兰素的快速检测方法。该方法在0.1～40.0 μg·mL-1线性关系良好，加标回收率和精密度均能满足实际检测的要求，可为奶粉中香兰素的质量监测提供重要参考依据。