miRNAs与斑块易损性研究进展

董芝芝 刘蓉 赵秋霞 陈悦

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院超声科，湖北 宜昌 443003)

脑卒中是我国死亡损失寿命年和伤残调整寿命年的首要原因〔1〕，部分脑卒中归因于颈动脉粥样硬化易损斑块破裂〔2〕。动脉粥样硬化是慢性炎症性疾病〔3〕，多基因和环境因素共同影响其发展〔4〕。早期检测颈动脉斑块易损性有助于识别高风险脑卒中患者〔5〕。研究表明微型核糖核酸(miRNAs)在动脉粥样硬化斑块的形成进展中起一定作用〔4，5〕，通过检测miRNAs表达水平，有可能预测颈动脉斑块易损性及脑卒中风险。

1 斑块易损性

1844年，丹麦艺术家Bertel Thorvaldsen的尸检结果首次报告了斑块破裂的概念。随后Davies描述了斑块破裂的特征及炎症在斑块易损性发展中的作用〔6〕。1989年，Muller等将血流动力学改变不明显、易破裂的斑块命名为易损斑块。易损斑块为具有破裂倾向、易于发生血栓形成和(或)进展迅速的危险斑块，主要标准为：活动性炎症(大量单核/巨噬细胞浸润)、薄纤维帽(厚度<100 μm)伴较大的脂核(成分>40%)、内皮细胞剥脱伴表面血小板聚集、有损伤或破裂倾向的斑块、重度狭窄；次要标准为：表面钙化结节、黄色反光、斑块内出血、内皮功能障碍、正性重塑〔7〕。

2 miRNAs

近年来，miRNAs(由18～25个核苷酸组成的短RNA)作为生物标志物和潜在的治疗靶点，在其作为疾病诊疗的关键介质作用备受关注。miRNAs与mRNA的3′非编码区(UTR)位点直接和(或)互补结合抑制基因表达，导致翻译抑制和(或)降解〔8〕，调节超过三分之一的人类基因〔9〕，是动脉粥样硬化斑块易损性的潜在调节因子〔3〕。miRNAs与细胞凋亡、细胞成熟、氧化应激、细胞外基质降解、血管生成和炎症反应、脂质代谢等有关〔10〕，可通过其表达水平调节平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的功能，影响动脉粥样硬化斑块发展的不同阶段。

3 miRNAs与斑块易损性的分子机制

3.1miRNAs调控血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型变化 平滑肌细胞是动脉粥样硬化斑块的主要成分之一〔3〕，在斑块发展过程中，易损斑块常显示为平滑肌细胞凋亡和(或)纤维帽中平滑肌细胞数量减少〔11〕，常见原因为血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型发生了变化〔4〕。

平滑肌细胞增殖、迁移可增加斑块纤维帽的稳定性。研究表明，细胞增殖和迁移可能是通过miRNAs调节细胞周期相关蛋白〔包括细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶(CDKs)及其抑制剂〕、靶向转化生长因子(TGF)-β信号通路(如miR-26a、miR-599)、激活胰岛素样生长因子(如miR-133)等引起的〔4〕。miR-221/miR-222通过抑制细胞CDK抑制剂p27kip1的表达促进血管平滑肌细胞增殖和内膜增厚，miR-221/miR-222的缺失可能是细胞增殖减少导致纤维帽变薄和斑块破裂的基础〔12〕。miR-181b过表达可升高细胞周期蛋白(cyclin)-CDK复合物，导致细胞S和G2/M周期激活，促进血管平滑肌细胞增殖和迁移。miR-638通过靶向孤核受体(NOR)1/cyclinD途径抑制血小板衍生生长因子(PDGF)-BB-诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移〔13〕。miR-210通过降低结肠腺瘤样息肉基因(APC一种多蛋白复合物)的表达，促进β-连环蛋白易位进入细胞核，激活无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)靶基因转录，可能是血管平滑肌细胞增殖的潜在机制之一〔14〕。

促进平滑肌细胞表型转换可能影响纤维帽完整性。正常情况下，平滑肌细胞为收缩表型，为了应答血管损伤和(或)炎症信号，平滑肌细胞去分化为合成表型(促动脉粥样硬化)〔11〕，有可能增加斑块易损性。miRNAs是平滑肌细胞表型转换的调节因子之一。miR-143/miR-145通过调节血管紧张素转换酶基因促进血管平滑肌细胞表型从收缩状态到增殖、迁移状态的转换〔15，16〕。研究发现miR-143/miR-145缺陷小鼠显示为收缩-合成表型转换的平滑肌细胞，其收缩能力降低〔4〕，增加斑块易损性。miR-21抑制血管平滑肌细胞中张力蛋白同源物基因(PTEN)、程序性细胞死亡蛋白(PDCD)4和Sprouty蛋白同源物(SPRY)1的翻译及其他mRNA靶点〔如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α和原肌球蛋白(TPM)1〕，有助于细胞从收缩表型向合成表型的转换〔16〕。miR-663通过增加血管平滑肌细胞分化标记的表达，如平滑肌α-肌动蛋白(SMA)、钙调素和平滑肌肌球蛋白重链(MYH11)等促进平滑肌细胞从收缩表型向合成表型的转换〔4〕。

因此，miRNAs有可能作为一种新型的生物标记物评估纤维帽厚度及斑块形态，从而评估斑块易损性，预测脑卒中风险。

3.2miRNAs调控巨噬细胞介导的炎症、凋亡 巨噬细胞是形成易损斑块的重要炎症细胞〔10〕，可介导免疫细胞、炎症因子的聚集〔17〕，miRNAs通过调节巨噬细胞分化及炎症，参与巨噬细胞生物学行为〔11〕，在斑块进展中产生影响。TOLL样受体(TLR)4配体刺激巨噬细胞，使其极化为M1炎症型(经典激活细胞)，白细胞介素(IL)-4刺激时巨噬细胞极化为M2抗炎型(交替激活)；M1炎症型激活后，小分子miRNAs上调，如miR-155等〔18〕。miR-155通过靶向转录抑制因子B细胞淋巴瘤因子(Bcl)6、髓样分化蛋白(MyD)88-和(TRIF)-依赖的信号通路诱导M1炎症型极化等调控巨噬细胞功能的多个方面，如炎症反应、细胞凋亡等。研究发现在低密度脂蛋白(LDL)受体敲除小鼠中，骨髓造血细胞缺乏miR-155通过巨噬细胞极化为M1炎症型增加斑块易损性，强调了miR-155在调节巨噬细胞谱系的炎症信号通路中的重要性〔11〕。miR-342-5p通过靶向丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)1增加巨噬细胞中miR-155的表达，促进促炎介质如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-6的表达〔18〕。miR-181b通过靶向Notch1信号(Notch信号的异常激活与巨噬细胞功能失调有关)调节巨噬细胞极化，影响动脉粥样硬化斑块易损性〔19〕。

动脉粥样硬化斑块形成过程中，miRNAs通过调节巨噬细胞自噬及线粒体功能增加胆固醇外流〔20〕，诱导内质网应激，促进巨噬细胞凋亡，使斑块内脂质坏死核心增加、纤维帽变薄，扩大斑块面积〔21，22〕。Canfrán-Duque等〔21〕在小鼠模型实验中发现miR-21在巨噬细胞中高度表达，miR-21缺失促进巨噬细胞在动脉壁中的浸润、增加巨噬细胞炎性细胞因子的诱导、加速诱导细胞凋亡，增加泡沫细胞形成，降低巨噬细胞吞噬能力。巨噬细胞自噬将脂滴运送到溶酶体内，溶酶体酸脂肪酶水解并清除胆固醇，miR-33过表达可通过自噬通路反向转运胆固醇、降低血清高密度脂蛋白(HDL)水平，加速游离胆固醇诱导的巨噬细胞凋亡和促炎症表型转化〔23，24〕，增加斑块易损性。综上，了解miRNAs调控巨噬细胞的潜在机制，通过阻断不需要的途径或将巨噬细胞分化调控为M2抗炎型，可成为临床易损斑块治疗的新靶点。

3.3miRNAs调控内皮细胞增殖、迁移、凋亡及炎症反应 内皮细胞在动脉粥样硬化斑块的发展中起一定作用。内皮细胞受损可致血管收缩异常，增加血小板聚集、白细胞黏附和血栓形成。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，miRNAs通过调节内皮细胞的增殖和迁移影响内皮功能，影响斑块易损性。miR-21、miR-126-3p、miR-24、miR-221、miR-222及miR-17-92簇的成员是内皮细胞中表达较丰富的miRNAs。miR-21在多种生理和病理过程中起重要作用，通过直接靶向WW结构域蛋白1、激活TGF-β信号通路，抑制内皮细胞增殖、迁移〔4〕。在内皮细胞中，miR-126表达上调通过靶向基质细胞衍生因子(SDF)-1(也称为CXCL12)〔25〕、Dlk1〔神经源位点缺口同源蛋白(Notch)1抑制剂，负性细胞周期调节因子〕〔4〕，促进内皮细胞增殖、迁移，以抵抗血流紊乱和高脂血症的促动脉粥样硬化作用，降低斑块易损性。

内皮细胞凋亡通过表现为内皮细胞功能障碍、破坏内皮的完整性、促进脂质沉积加速动脉粥样硬化〔26〕，可能增加斑块易损性。miRNAs参与了动脉粥样硬化的病理过程，可调控内皮细胞凋亡。let-7g过表达通过靶向抑制半胱氨酸蛋白酶(CASP)3(细胞凋亡的执行者)降低ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡〔10〕。miR-495通过抑制趋化因子(CCL)2促进单核细胞进入动脉粥样硬化斑块并诱导内皮细胞凋亡促进动脉粥样硬化，增加斑块易损性。PTEN是肿瘤抑制基因，通过负性介导胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路、负性介导中性粒细胞趋化和减少组织损伤发挥抗炎作用，而miRNA-26a-5p通过靶向PTEN激活PI3K/Akt通路，抑制内皮细胞凋亡〔27〕和炎症反应。

在生物化学和生物力学刺激的共同作用下，动脉粥样硬化疾病的早期特征是内皮细胞激活，表达一组黏附分子，如血管细胞黏附分子(VCAM)-1、细胞间黏附分子(ICAM)-1和E-选择素〔11〕，促进炎症反应及动脉粥样硬化斑块形成，增加斑块易损性〔28〕。miRNAs可调节内皮细胞炎症反应。如在动脉粥样硬化的早期阶段，miR-21通过激活VCAM-1增加黏附分子及促炎细胞因子表达，增加内皮细胞炎症反应〔16〕。miR-92a通过靶向G蛋白信号调节因子(RGS)3、Krüppel样转录因子(KLF)2、KLF4分别抑制TGF-β/母亲信号蛋白同源物(Smad)信号传导、NF-κB途径、IL-1β，抑制内皮细胞增殖和炎症反应，减缓动脉粥样硬化进展〔9〕，降低斑块易损性。miR-155 和miR-221/miR-222通过靶向转录因子Ets-1及其下游基因(包括VCAM-1和单核细胞趋化蛋白-1)抑制血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞炎症反应〔11〕，有可能降低斑块易损性。

目前研究结果只能表明miRNAs与内皮细胞功能、斑块易损性有一定相关性，但调控功能的主要miRNAs尚未说明，其具体类别及影响机制还需更多实验阐明。

4 miRNAs与脂质代谢

血液循环中过量的LDL及胆固醇在血管内皮下积聚，诱导局部氧化和酶修饰引起免疫应答，形成斑块进展的慢性炎症环境〔11〕。胆固醇流出能力(维持胆固醇内稳态)是动脉粥样硬化的预测因子之一。三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)A1是调节胆固醇代谢的关键分子，通过向载脂蛋白受体输出胆固醇和磷脂调节HDL生成〔29〕。miR-33家族在胆固醇流出和HDL代谢(ABCA1和ABCG1)、脂肪酸氧化、胆汁酸合成和分泌等相关基因的调控中具有重要作用〔24〕。研究发现，抑制miR-33可降低血浆极低密度脂蛋白(VLDL)含量，而增加血浆HDL含量〔30〕。Nishino等〔23〕用miR-33b敲入人化小鼠模型证明胆固醇调节元件结合蛋白-1(SREBF)1-miR-33b轴促进动脉粥样硬化、斑块核心坏死区域和巨噬细胞浸润增加、纤维化成分减少，表明miR-33b通过调节胆固醇量增加斑块易损性。miR-126-5P通过抑制Dlk1、Notch1使细胞通透性增加，导致LDL大量进入血管壁促进动脉粥样硬化斑块进展〔31〕，增加斑块易损性。miR-494表达上调通过HDL将胆固醇从血管壁转移到肝脏，减少动脉粥样硬化斑块中坏死核心的大小〔30〕。miR-27、miR-144、miR-145、miR-223 和 miR-758在转录后通过抑制ABCA1表达调节细胞胆固醇流出至载脂蛋白〔11〕，影响斑块易损性。由此可见，通过抑制或激活相应的miRNAs，可在一定程度下减轻血管壁的脂质沉积，降低循环血脂水平，从而降低临床心血管事件的风险。

5 miRNAs与斑块内新生血管

新生血管是动脉粥样硬化斑块发展早期的一个显著特征，因新生血管脆弱且易塌陷，导致斑块内出血、血栓形成、释放化学介质、产生炎症细胞，增加斑块易损性〔31，32〕。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，不同的miRNAs可能与血管生成有关。let-7、miR-126、miR-143/145、miR-155、miR-17-92簇和miR-221/ miR-222可以调节斑块内新生血管生成。let-7通过敲除小鼠体内的内切核糖核酸酶(Dicer)和核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)，使let-7a、let-7b、let-7c、let-7f和let-7g降低30%以上，影响血管生成。let-7a、let-7b和let-7f的减少有助于新生微血管的形成〔10〕。miR-126可通过维持血管内皮生长因子(VEGF)表达水平、下调表皮生长因子样结构域(EGFL)-7(与VEGF协同促血管生成)，促进新生血管生成〔25〕。因此，通过检测循环中miRNAs表达水平，有可能评价新生血管密度，成为评估斑块内新生血管的方法之一。

综上，颈动脉粥样硬化易损斑块破裂可导致脑卒中。miRNAs在动脉粥样硬化斑块进展过程中起重要作用，通过检测血液循环和斑块内miRNAs表达水平为参考依据，有可能预测斑块易损性及脑卒中风险，对颈动脉易损斑块提供诊疗策略，从而寻找颈动脉易损斑块miRNAs治疗的新靶点。