取向静电纺丝支架在肌腱和韧带修复中的应用研究进展

盛旦丹 陈俊 陈世益

1 复旦大学附属华山医院运动医学科（上海 200040）

2 聚合物分子工程国家重点实验室（复旦大学）

1 引言

肌腱和韧带损伤是一种常见的运动医学疾病。肌腱和韧带损伤后往往难以自我修复，保守治疗无法缓解症状的患者通常需要通过外科手段进行干预治疗，严重的肌腱和韧带损伤更是需要借助移植物进行修复[1-3]。常用的移植物种类包括自体、同种异体、异种异体和人工移植物。其中，自体移植物会引起供区损伤，同种异体和异种异体移植物可引起免疫排斥反应和潜在的疾病传播风险，而无论自体、同种异体还是异种异体移植物，都受到来源限制以及移植物力学性能下降的影响[4]，此外，人工移植物存在组织诱导性低、无法使自体组织很好地长入从而与宿主组织进行整合的情况[5]。所以，越来越多的研究人员将焦点转移到组织工程支架材料的开发上，寻求通过组织工程的方法修复肌腱和韧带损伤[6]。

对于肌腱和韧带的再生，理想的组织工程支架应具备刺激、调节细胞向所需的表型分化和朝着所需的结构生长以恢复天然肌腱和韧带组织结构和力学特性的功能，包括使细胞向肌腱/韧带/骨样表型分化、细胞黏附形态有序排列以及产生丰富的细胞外基质（extra⁃cellular matrix，ECM）等[7]。静电纺丝技术为肌腱和韧带这类富含ECM、具有高度等级结构的组织提供了一种制备仿生支架材料的方法。

静电纺丝技术发端于1934年[8]，自20 世纪80年代纳米技术兴起后，经过美国Reneker[9]和Rutledge[10]课题组对静电纺丝工艺和应用深入而广泛地研究推动，静电纺丝技术的发展进入快车道。经典的静电纺丝装置主要包括三个组成部分：高压电源、喷丝装置和接收装置。高分子聚合物溶液在强电场下从喷丝装置中高速射出后，经过挥发性成分的快速蒸发，在接收装置上固化成纤维。鉴于静电纺丝技术制备的纤维材料具有可调节比表面积、孔隙率、孔结构、功能性等优势，目前已广泛应用于环境、能源、传感器、化学工程、生物组织工程等领域[11]。随着研究的不断深入以及终端需求的不断变化，研究者们在对喷丝装置和接收装置进行改进后，已可制备一系列结构、排列多样的纤维，包括实心、空心、核-壳结构的纤维和无规、取向、图案化排列的纤维等[12-14]，并可通过理化处理或添加生物活性分子等后处理方法进行功能化改性以满足不同需求的组织损伤修复[15，16]。其中，取向排列设计的纤维支架材料其纤维沿轴向整齐排列，因其可显著提高支架在纤维轴向的力学性能以及影响细胞的迁徙、分化等生物学特性而引起运动医学相关研究人员的极大关注[17，18]。本综述重点介绍取向静电纺丝支架在肌腱和韧带修复中的应用研究情况，并尝试展望未来取向静电纺丝支架在肌腱和韧带修复中的应用研究前景。

2 取向静电纺丝支架在肌腱和韧带修复中的应用

2.1 模拟骨-腱-骨结构的取向静电纺丝支架

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤后会严重影响膝关节运动功能，久而久之导致关节退变和骨关节炎的提早发生，因此需要进行ACL 重建以尽快恢复膝关节稳定性[19]。取自体中1/3 骨-髌腱-骨（bone-patellar tendon-bone，B-PT-B）作为移植物进行ACL重建是目前临床ACL重建的金标准[20]。

为了研发贴近B-PT-B的静电纺丝支架，研究人员开展了制备骨-腱-骨结构支架的探索。Samavedi 等[21]通过增加喷丝装置数量和利用辊筒与挡板相结合的接收装置，制备了由无规聚丙交酯-乙交酯[poly（lactideco-glycolide），PLGA]纤维区、取向聚己内酯（polycapro⁃lactone，PCL）纤维区和两者纤维过渡区组成的三段式薄膜，并利用可光交联的聚乙二醇二丙烯酸酯（polyeth⁃ylene glycol diacrylate）水凝胶将其加工成圆柱形复合支架以模拟骨-腱-骨结构的形状。研究表明，在薄膜上培养骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）时，BMSCs 在取向PCL 纤维区表现出较高的生长方向一致性和长宽比，而在无规PLGA纤维区表现出随机杂乱的生长方向和较低的长宽比。进一步，Lin等[22]利用一对锥筒样接收装置，仅用单喷丝装置同样制备了“无规-取向-无规”纤维排列结构的PCL纳米纤维支架，并将无规纤维排列区域浸泡在5×模拟体液（sim⁃ulated body fluid，SBF）中覆盖一层矿物，以更好地模拟骨-腱界面。结果表明，支架不同区域上种植的BM⁃SCs 表现出不同的特异性谱系分化。在取向区域肌腱和韧带的特异性标志物腱调蛋白（tenomodulin，Tnmd）和Mohawk（Mkx）明显上调，与无规区域相比分别上调3.5倍和20倍以上。相反，在矿化的无规区域骨的特异性标志物骨钙素（osteocalcin，OCN）和骨桥蛋白（osteo⁃pontin，OPN）则显著上调。制备模拟B-PT-B结构的取向静电纺丝支架，其优势在于可修复复杂部位的肌腱和韧带损伤，例如前/后交叉韧带等，同时，其在实际临床应用中所要面临的挑战也是艰巨的，作为模拟骨-腱-骨结构的移植物，如何实现移植物骨道段与自体骨的整合、移植物整体力学强度是否充足等问题是未来需要攻克的难关。

2.2 模拟止点结构的取向静电纺丝支架

肌腱和韧带与骨相连的界面称为止点（enthesis），作为软硬两种组织的交界处，其组织学结构较为特殊，分为四个部分：（1）肌腱和韧带纤维区域；（2）纤维软骨区域；（3）矿化的纤维软骨区域；（4）骨区域。止点的修复也是当今骨科运动医学领域的治疗难点和研究热点。

为了修复止点，研究人员从模拟组织结构、恢复梯度矿化结构着手，通过结构仿生和成分仿生角度进行了相关研究。Xie 等[23]通过在取向PCL 纤维上梯度沉积无规PCL 纤维以模拟止点结构。Criscenti 等[24]则将3D打印技术与静电纺丝技术相结合，制备了一种三段式支架，由直径208 ± 7.1 μm的PCL 3D打印纤维区、直径0.588 ± 0.02 μm 的PLGA 取向静电纺丝纤维区和两者的重叠区组成，三个区域的孔隙率分别为77.1% ± 1.7 %、95.9% ± 1.6 %和80.2% ± 2.7 %。这样差异性的结构引起了不同区域不同的力学性能和生物学反应。Cai等[25]则以丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯制备了无序与有序双层堆叠的纳米纤维支架，以改善止点的微观梯度结构促进腱与骨的修复整合。但是仅仅从结构角度模拟止点区域结构还无法使研究人员感到满意，进而有学者提出了从成分仿生角度切入的设计思路。Li等[26]提出了一种简单的制备梯度矿化支架的方法，将制备好的静电纺丝膜呈一定角度斜置于烧杯中，并以恒定速度持续向烧杯中加入SBF，根据烧杯内静电纺丝膜上下部分浸泡时间的不同从而得到梯度矿化支架。进一步，Samavedi等[27]在制备得到掺杂纳米羟基磷灰石（nano hydroxyapatite，nHAP）的PCL静电纺丝膜后，再将其经过5×SBF 浸泡处理以更好地模拟矿化梯度，能谱分析测得nHAP-PCL 纤维上的平均钙磷比为1.48，稍低于HAP的1.67，作者认为可能是SBF中的镁离子和钾离子干扰所致。这种成分仿生的制备思路使得骨形态发生蛋白-2 和OPN 的基因表达在矿化区得到增强，利于止点区域骨组织的再生[28]。此外，He等[29]通过设置接收辊筒的滚动角度，两步法制备了两端掺杂nHAP的PLGA静电纺丝膜，既从结构上模拟了从无规到取向，又从成分上模拟了从矿化到无矿化。Cong等[30]的研究通过利用PCL有序与无序多层堆叠并添加ColⅠ、Col Ⅱ和nHAP 同样做到了从结构和成分两个角度对止点结构进行模仿。这些研究都表明取向静电纺丝支架可以对止点结构进行模拟，并有利于促进止点修复，但是目前大多数研究仍局限在小动物模型上，未来在多角度仿生制备材料的同时需要进一步验证该类材料在大动物模型上的实验结果并观察远期疗效。

2.3 模拟体部结构的取向静电纺丝支架

肌腱和韧带区别于其他结缔组织的关键在于胶原纤维的特殊排列结构。这些胶原纤维的排列方向与韧带纤维长轴方向是一致的，正是得益于这种近乎平行的胶原纤维排列结构才使得肌腱和韧带在纤维轴向排列方向上具有优异的力学载荷与抗张性能[31]，从而在人体运动中发挥重要作用。

为了修复肌腱和韧带的体部损伤，研究人员从多角度对取向静电纺丝支架开展了研究。Sahoo等[32]观察到将释放碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的PLGA 纤维涂覆在编织的蚕丝支架上能够刺激间充质祖细胞的增殖、分化。因此，Liu 等[33]针对延长bFGF 在支架中的活性进行了研究，他们将负载bFGF 的葡聚糖玻璃纳米颗粒（dextran glassy nanoparticles，DGNs）包裹进聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）纤维支架中以确保bFGF 的生物活性。结果显示，bFGF/DGNs-PLLA 支架的蛋白质包封率达到48.71% ± 13.53%，释放时间接近30天，能更好地促进细胞增殖和损伤愈合。Olvera等[34]研究显示，在没有生长因子刺激时，与无规纤维支架组中的BM⁃SCs 相比，取向纤维支架组中的BMSCs 显示出较高水平的TNMD 和聚蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达。在使用结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）刺激的情况下，BMSCs可向腱系进行分化，两组TNMD表达均增加，其中取向纤维支架组TNMD表达更高；当使用转化生长因子β3刺激时，无规纤维支架组的BMP-2 表达较高，这提示无规纤维支架是更适合表达软骨内表型的基质材料；当两种生长因子连续刺激时，与使用单一生长因子刺激相比，取向纤维支架组表达出更高水平的总胶原沉积量。类似研究中，Pauly 等[35]将CTGF 结合在取向纳米纤维束表面并植入皮下，6周后通过免疫组化观察到CTGF结合的纳米纤维束周围I型和Ⅲ型胶原染色较未结合CTGF 的纳米纤维束更均匀。此外，Manning 等[36]将血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）与脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs）一起掺入基于肝素和纤维蛋白的水凝胶中，然后用PLGA纤维薄膜对水凝胶进行分层并提供结构支撑，以此实现PDGF-BB 和ASCs 的手术递送。结果显示细胞在支架中保持活力并且实现了生长因子的持续释放，术后9 天仍可发现肌腱修复部位荧光标记的ASCs 和支架，总DNA 表达也增加。Orr 等[37]还对细胞浸润多层支架的情况进行了研究，除发现取向纤维组的Col Ⅲ和TNMD 基因表达高于无规纤维组外，研究还发现在细胞与支架共培养28天后，尽管取向和无规纤维支架中均显示细胞在支架的全厚度中有浸润，但根据天狼猩红染色评估，仅取向纤维支架组在整个支架厚度上显示出明显的红色双折光和有序的胶原纤维排列，这为取向纤维支架早期的机械性能的增加提供了有力证据。Yang等[38]则采用PCL和甲基丙烯酸酯明胶（methacrylated gelatin，mGLT）共纺方法制备了可光交联的多层取向纤维支架，结果证明光交联的方法能使mGLT 更加均匀地分布在整个支架内的同时维持支架的机械强度，且植入多层支架内的细胞仍能对支架形貌和外源性生长因子产生反应。另外，Chen 等[39]通过包埋吸附了一氧化氮（nitricoxide，NO）的金属有机框架纳米颗粒构建的同轴PCL/明胶（gelatin，Gel）取向静电纺丝支架，能够较稳定地缓释介导血管生成的NO达15 天，从而使PCL/Gel 取向静电纺丝支架具有较持久的促血管生成作用，增加韧带修复时的血供，利于组织在更短的修复时间内获得更高的生物力学强度。当然，肌腱和韧带修复术后的防粘连问题也是许多学者努力克服的方向之一。Jiang[40]、Lui[41]等分别通过在取向静电纺丝支架中加入萘普生钠、塞来昔布等物质来抑制粘连发生，并确定ERK1/2 和Smad2/3 磷酸化是早期粘连形成过重的关键驱动因素，可通过下调ERK1/2和Smad2/3 磷酸化来阻断粘连。以上针对模拟肌腱和韧带体部损伤的取向静电纺丝支架研究，均表明该类材料在加强肌腱和韧带体部损伤修复方面具有优势，但是该类材料由于成骨作用有限，故在涉及止点结构的修复中应用较少。此外，由于纳米纤维的有序排列结构易导致支架在术中被缝合线割裂，所以提升纤维间的作用力将有助于更好地推动材料面向实际应用。

2.4 机械性能

虽然以上研究表明取向纤维结构的静电纺丝支架能够通过各种方式促进细胞的黏附、增生、迁移、基因表达和基质沉积等，但如果取向静电纺丝支架应用到临床时不能拥有足够的机械性能，这些积极的特性可能是无关紧要的[42]。因此，一些研究人员对如何提高静电纺丝支架的机械性能展开了研究。Kolluru等[43]的研究发现静电纺丝制备椭圆形横截面的纳米纤维相比于圆形和不规则横截面的纳米纤维有更高的强度和更韧的弹性。Pauly等[44]的研究也发现通过改变PCL纳米纤维的排列方向和几何形状能够显著影响支架的机械性能，取向纤维薄片具有最大的弹性模量，比无规纤维薄片高125%，比取向纤维束高45%。将上述取向纤维薄片卷曲为取向纤维束可增加大约107%的屈服应力和140%的屈服应变，并使纤维束的机械性能处在天然ACL 的机械性能范围内：弹性模量达到158 ± 32 MPa，屈服应力达到57 ± 23 MPa，屈服应变达到0.38± 0.08。Sheikh 等[45]还通过将多壁碳纳米管掺入医用级聚氨酯溶液中，将取向静电纺丝支架的拉伸应力提高到了72.78 ± 5.5 MPa。此外，Surrao[46]、Vaquette[47]、Banik[48]等还研发出了具有与天然肌腱和韧带组织类似“S”形力学特征曲线的取向静电纺丝支架，曲线包含脚趾区和线性弹性区。

另外，由于术后早期康复有助于患者尽快重返运动，因此研究机械性能对肌腱和韧带修复中细胞和组织的影响也是近些年来的热点。Lee 等[49]研究了不同方向的动态拉伸刺激对成纤维细胞的影响，结果发现成纤维细胞对与自身长轴方向一致的机械刺激更为敏感。Karchin等[50]研究了不同大小的拉伸应变幅度对成纤维细胞的影响，结果显示与高应变幅度（10%）相比，低应变幅度（3%）可显著增加细胞在取向纤维支架上的I型胶原基因表达。Bosworth等[51]则研究了PCL静电纺丝纱线在动态拉伸载荷下对BMSCs的影响。将BM⁃SCs种植在纱线上，每天接受5%应变、1 Hz、3600次循环的力学刺激，持续21 天，结果显示与静态培养的纱线相比，受到动态拉伸载荷影响的纱线在不改变细胞的单轴生长方向的情况下会增厚纱线周围的细胞层，表明细胞增殖和基质沉积速度加快，同时ColⅠ型胶原的基因表达也上调，证实机械刺激可以对BMSCs 向腱系方向分化产生影响。Barber 等[52]应用循环张力刺激负载于支架上的BMSCs 也得到了相似的结果，证据是Scleraxis 基因表达的显著上调。此外，Thayer 等[53]发现弹性模量对BMSCs 的分化也有一定的影响，研究共制备了31、15和5.6 MPa三种弹性模量的取向纤维支架，结果发现BMSCs 在5.6 MPa 组中Scleraxis 和α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达高于弹性较硬的另外两组，并显示在5.6 MPa 组中细胞的生长更具方向性。以上研究结果为术后早期康复的理论基础提供了一定的参考依据，但是仍停留在细胞层面，未来可通过活体肌骨系统软组织应变相关测量方法的进步在取得相关数据后进一步指导取向静电纺丝支架的制备[54]。

3 总结与展望

组织工程在修复肌腱和韧带损伤、改善术后疗效中有巨大的医疗应用潜力。然而，虽然与组织工程相关的医疗产品研发和申报数量日益增多，但以“肌腱”、“韧带”为关键词从国家药品监督管理局医疗器械技术评审中心查询，仅可得到3 款注册植入物产品（1 款为国产同种异体肌腱修复材料，1款为同种异体肌腱植入物[55]，1 款为进口人工韧带及附件[56]）。因此，我们仍需加大加快针对肌腱和韧带损伤修复的产品研发，从而更好地满足患者的健康需要。

取向静电纺丝支架因其优良的生物相容性、形貌特征、机械性能等特点而在肌腱和韧带的损伤修复方面得到广泛的研究。当前研究主要是制备仿生肌腱和韧带骨-腱-骨结构、止点结构、体部结构的取向静电纺丝支架并研究机械特性对损伤修复的影响，已尝试通过结构仿生、成分仿生、功能仿生等各种策略解决由于肌腱和韧带自身修复能力较差导致的组织结构紊乱和功能水平下降问题，使得制备得到的取向静电纺丝支架能够促进更多的胶原沉积以及干细胞向腱系、软骨系和骨系分化，但离真正产业化仍有很长的路要走。