不同净化方法对甘草有机氯农药残留测定的比较研究

廖予菲，王 萍，张瑞瑞，程茜菲

（陕西国际商贸学院医药学院，西安 712046）

甘草（Glycyrrhiza uralensis）被誉为“中药之王”，其始载于《神农本草经》［1］，为传统医学中常用的上品药材，其栽培过程中易受病虫害影响，为保证品质和产量常使用各种农药，易造成多种农药残留。甘草一般3年采收，药用部位为其根类，易受到环境中残留的有机氯类农药影响［2］。因此，为保障用药安全，中国药典中对甘草药材的有机氯农药残留量有着严格的限制。

现行中国药典有机氯类农药残留量测定法为GC法，与之相匹配的净化方法包括磺化法（9种有机氯类农药残留量测定法）、柱层析法（22种有机氯类农药残留量测定法）［3］。磺化法是通过浓硫酸与提取液中脂肪、蜡质等杂质发生磺化反应，将目标化合物与杂质分离，对酸稳定且不易氧化的有机氯类农药较为适用［4］，但磺化法的操作步骤较多，所耗费时间久，无法实现有机氯类农药的快速测定。QuEChERS是一种快速高效的样品前处理方法，近年来，在农药残留量检测领域得到了广泛应用，中国药典2020版中将该方法作为禁用农药残留测定的前处理方法之一［5，6］。

本研究对比了磺化法及QuEChERS法2种样品净化方法，以期为快速高效测定中药中的有机氯类农药残留提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验仪器Agilent 7820型气相色谱仪（配电子捕检测器），美国安捷伦科技有限公司；TE124S型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ5200DE型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HC-3018R型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；MTV1-100型多管涡旋混合仪，杭州奥盛仪器有限公司。

1.1.2 试验试剂9种有机氯农药混合对照品100 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司，批号105198。QuEChERS萃取盐包、QuEChERS dSPE样品萃取净化管，日本岛津制作所；乙腈（色谱纯），美国Fiher公司；丙酮（农残级），德国Merck公司；石油醚（60～90℃）（农残级）、氯化钠（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷（农残级），天津科密欧化学试剂有限公司；硫酸、无水硫酸钠为分析纯。甘草（批号：1903021119A、2005021119A，产地内蒙古，河北盛泰药业有限公司），由陕西国际商贸学院王萍副教授鉴定为胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）的干燥根，经前期检测，2005021119A未检出农药残留，可作为阴性空白，1903021119A检出六六六、滴滴涕。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱选择Agilent DB-1701型弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样方式为不分流进样；进样温度为230℃；检测器温度为300℃；进样体积为1 μL；柱流量为60 mL/min。

升温程序：从100℃开始，不保持，以10℃/min升温至220℃，再以8℃/min升温至250℃，持续10 min。

1.2.2 对照品溶液配制 精密量取9种有机氯混合对照品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶，取石油醚（60～90℃）稀释定容至刻度，作为对照品储备溶液。

精密量取上述混合对照品储备溶液5、25、50、250、500、1 250 μL分别置于10 mL容量瓶，加石油醚（60～90℃）稀释至刻度，作为标准系列工作溶液。

1.2.3 供试品溶液制备

1）磺化法。甘草样品粉碎混匀，过三号筛，精密量取2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加去离子水20 mL浸泡过夜，精密量取丙酮40 mL，称定并记录重量，超声30 min，放冷至室温，再次称定重量，滴加丙酮补足减失的重量，加入氯化钠约6 g，精密加入二氯甲烷30 mL，称定重量，超声处理15 min，再称定重量，滴加二氯甲烷补足减失的重量，静置使分层，将上层溶液迅速转移至装有适量无水硫酸钠的100 mL具塞锥形瓶中，静置4 h。精密分取35 mL，于40℃水浴减压浓缩至近干，加少量石油醚（60～90℃），反复操作至丙酮及二氯甲烷除尽，用石油醚（60～90℃）溶解并转移至10 mL具塞刻度离心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀释至5 mL，小心加入硫酸1 mL，涡旋1 min，3 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液2 mL，置于刻度离心管中，40℃下氮吹浓缩至适量，精密稀释至1 mL，过0.22 μm滤膜即得。

2）QuEChERS法。甘草样品粉碎混匀，过三号筛，精密量取2 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，涡旋使混匀，置 振 荡 器 上 剧 烈 振 荡（500次/min）5 min，加 入QuEChERS萃取盐包，立即摇散，再置于振荡器上剧烈振荡（500次/min）3 min，于冰浴中冷却10 min，离心（4 000 r/min）5 min，取上清液9 mL，置于QuECh-ERS dSPE样品萃取净化管中，涡旋使充分混匀，置于振荡器上剧烈振荡（500次/min）5 min使净化完全，离心（4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹仪上于40℃水浴浓缩至近干，加石油醚（60～90℃）稀释至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜即得。

1.2.4 线性关系考察 精密吸取“1.2.2”中标准系列工作溶液各浓度1 μL分别注入气相色谱仪，每个浓度重复测定2次，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 测定法 按“1.2.1”中色谱条件操作，精密吸取“1.2.3”中2种方法处理的供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，分别连续进样2次，取2次平均值，按外标法计算供试品中农药残留量。

1.2.6 重复性对比研究 取批号为1903021119A的供试品粉末，分别按照“1.2.3”中2种方法各制备6份样品，每份重复测定2次，按标准曲线法计算出供试品中农药残留量。

1.2.7 检测限对比研究 取批号为2005021119A的供试品粉末，通过比较低浓度分析物样品与空白样品测量的信号，依据信噪比为3∶1对应的最低浓度为检出限的规定，倍比稀释相应浓度的对照品溶液加入供试品，分别按照“1.2.3”中2种前处理方法各制备3份样品，每份重复测定2次。

1.2.8 加标回收率对比研究 取批号为1903021119A的供试品粉末，精密称定9份，分别精密加入50 ng/mL的混合对照品溶液3、6、9 mL各3份，按“1.2.3”中的磺化法制备，每份重复测定2次。同法测定QuECh-ERS法制备样品的加标回收率数据。

2 结果与分析

2.1 色谱图及线性关系考察

2种净化方法所制样品中杂质对9种有机氯测定均无干扰，由图1可以看出，QuEChERS处理效果更佳，杂质较少。线性考察结果见表1，结果表明，六六六、滴滴涕、五氯硝基苯在浓度为1.00～250.00 ng/mL时与峰面积呈良好线性关系。

表1 标准曲线回归方程

图1 甘草有机氯农药残留量检测气相色谱

2.2 重复性、检测限对比研究结果

批号为1903021119A的供试品中δ-BHC、OP＇-DDT有检出，如表2所示，磺化法所制样品2种农药残留量的相对标准偏差（RSD）分别为2.01%、3.23%；QuEChERS法所制样品2种农药残留量的RSD分别为1.76%、1.55%。2种前处理方法的检出限测定结果见表3，相较而言，QuEChERS法比磺化法更具优势。

表2 两种前处理方法重复性试验结果 （单位：mg/kg）

表3 两种前处理方法检出限试验结果 （单位：mg/kg）

2.3 加标回收率对比研究结果

磺化法加标回收率测定结果见表4，QuEChERS加标回收率测定结果见表5。采用SPSS 25.0软件对回收率对比试验结果进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差表示。数据均采用独立样本t检验，P≤0.05认为有显著性差异。结果（表6）显示，2种方法对大部分有机氯农药回收率结果无显著性差异，而对α-BHC、β-BHC 2种农药残留回收率结果表明，QuEChERS法回收率显著高于磺化法，该方法操作简单，步骤少，能相应减少样品处理过程中分析对象的损失。

表4 磺化法加标回收率测定结果

表5 QuEChERS法加标回收率测定结果

表6 两种前处理方法回收率测定结果比较

3 小结与讨论

3.1 甘草农药残留量测定前处理

对甘草样品进行前处理时，因样品纤维较多，难以完全粉碎后通过3号筛，容易造成平行样品之间RSD偏大的现象，应尽量做到粉碎完全，混合均匀取样，也可通过增加平行样个数来解决这一问题。此外，在通过磺化法处理甘草样品时，因其含多糖类成分，试验操作至“40℃水浴减压浓缩至近干”时，易出现黏稠挂壁物质，为了避免农药残留损失，不宜浓缩至太干，转移至离心管的操作应取适量石油醚（60～90℃）进行充分洗涤。

3.2 甘草样品有机氯农药残留情况

有机氯农药脂溶性强，化学性质稳定，残留时间久，易在生物体中富集，造成肝、肾、神经等损伤，是药品标准中重点控制的重要污染物。甘草作为根茎类药材极易富集农药残留，《中国药典》2020版一部要求甘草“含五氯硝基苯不得超过0.1 mg/kg”。本试验采购了15批次甘草进行农药残留量测定，从结果来看，大多数批次饮片有痕量六六六、滴滴涕或五氯硝基苯等农药检出，但总体符合药典要求，满足药用原料要求。

本试验以甘草作为研究对象，采用气相色谱法，分别通过磺化法及QuEChERS法进行样品净化处理，通过考察方法的稳定性、重复性、回收率、检测限，对2种前处理方法进行评价。结果表明，2种方法均能专属、快速、灵敏、准确地实现样品处理分析，均可作为甘草有机氯农药残留量测定的前处理方法，但综合经济成分和时间成本分析，QuEChERS法操作简单，步骤少，较适合作为甘草样品农药残留量测定的净化方法。QuEChERS法没有磺化法适用范围窄的缺点，可推广到其他类型农药残留检测中。但中药往往基质复杂，该方法对于其他药材或中成药农药残留测定是否适用，仍需进一步试验验证。

续表4

续表5

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