青霉属真菌Penicillium sp.1502次级代谢产物鉴定及其生物活性研究

张亚妮，刘曼莉，张志刚，万中义，吴兆圆，王开梅，方 伟

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

青霉属（Penicillium）真菌是广泛存在于自然环境中的一类腐生类真菌。其与大部分腐生类真菌一样可以产生萜类、聚酮类、生物碱类、大环内酯类和醌类等次级代谢产物，这些次级代谢产物在抗菌、抗病毒、抗肿瘤或抗心血管疾病以及抗虫等方面表现出不同的活性［1-3］。其中，一些代谢产物已经被开发成药物，例如目前具有广谱抗菌活性的青霉素，已经用于临床医学的洛伐他汀和抗真菌的灰黄霉素［4］。近年来，又发现不少青霉属真菌来源的结构新颖且活性良好的代谢产物，如新骨架二倍半萜类化合物peniroquesine A至peniroquesine C，它们是从1株娄地青霉Penicillium roquefortiYJ-14中分离所得，peniroquesine B和peniroquesine C对多种肿瘤细胞均有一定的抑制活性，尤其是对人乳腺癌细胞（MCF-7）的体外细胞毒性较强，IC50分别为16.40、14.11 μmol/L，显著高于 阳性对照cisplatin（IC50为33.55 μmol/L）［5］。新的聚酮类化合物isochaetochromin A1与已知化合物isochaetochromin B1及isochaetochromin B2源自同一株青霉属真菌FKI-4942，均具有抑制甘油三酯合成的作用，其中isochaetochromin B1的抑制作用最强，IC50为5.6 μmol/L［6，7］。新的硫代二酮哌嗪生物碱penicibrocazine A至penicibrocazine E，这5个生物碱分离自红树植物白骨壤的内生真菌青霉菌Penicillium brocaeMA-231发酵液中。化合物penicibrocazine B至penicibrocazine D均对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有较强的抑制活性，其最低抑菌浓度（MIC）分别为32.00、0.25、8.00 μg/mL；化合物penicibrocazine C对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）表现出明显高于阳性对照氯霉素（MIC2.0 μg/mL）的抑制活性，其MIC为0.25 μg/mL。此外，化合物penicibrocazine A至penicibrocazine C对植物病原真菌小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）表现出较强的抑制活性，其MIC分别为0.25、8.00、0.25 μg/mL［8］。不断发现的次级代谢产物扩展了青霉属真菌化合物结构及生物活性的多样性，为新的药物开发提供了研究基础。

湖北省生物农药工程研究中心拥有丰富的微生物资源，在从真菌来源中筛选具有生物活性的次级代谢产物过程中，发现1株具有抑菌活性的菌株，经ITS rRNA鉴定为青霉属Penicilliumsp.KC345662，编号为NH-1502。对其发酵提取物进行HPLC-MS初步分析，发现其含有丰富多样的次级代谢产物。为了明确这些次级代谢产物的化学结构，对菌株Penicilliumsp.1502进行了大量发酵、提取、分离纯化，获得了化合物1至化合物6，并在实验室条件下对其进行了抑菌、抗植物病原真菌及杀虫等活性评价，以期为青霉属来源的次级代谢产物在农用方面的研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 真菌NH-1502，分离自武汉市周边的土样中，现保存于湖北省生物农药工程研究中心。菌株经ITS分析比对，其序列与Penicilliumsp.KC345662高度相似（相似度为100%），鉴定为青霉属真菌Penicilliumsp.1502，保存编号为NH-1502。

1.1.2 抗细菌生测指示菌 大肠杆菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylicoccus aureusATCC 25923）购自中国典型培养物保藏中心，猪丹毒杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiaeWH13013）、猪链球菌（Streptococcus suisSC19）由华中农业大学谭臣教授课题组提供（在无菌条件下将菌液与30%浓度甘油1∶1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为15%，-20℃超低温冰箱中保存）。

1.1.3 抗真菌生测指示菌 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麦颖枯病菌（Septoria nodorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Hiveum）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）均分离于染病植物的果实或叶片（所测试病原真菌保存在-80℃超低温冰箱25%甘油管中，使用前将甘油管活化于PDA平板备用）。

1.1.4 供试昆虫 豆蚜（Aphis craccivora）由湖北省生物农药工程研究中心通过野外蚜虫驯化培养所得。

1.1.5 仪器和主要试剂Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振仪（TMS为内标，δ为mg/L，J为Hz）（德国Bruker BioSpin公司）；BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋转蒸发仪（瑞士步琦）；Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）、Waters高效制备液相色谱仪（Waters2525泵，带2767自动收集系统，Waters2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）、Waters Xevo TQD UPLC-MS超高效液质联用（美国Waters）；提取分离用试剂甲醇、乙酸乙酯和乙腈均为国药集团生产；去离子水（德国默克）；春雷·王铜（春雷霉素含量2%，王铜含量45%），购自陕西麦可岁生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株发酵和提取 菌株NH-1502在种子培养基（PDA）中于28℃，以转速120 r/min进行振摇培养。发酵96 h后，在无菌条件下将种子发酵液（10%）转移至含有发酵培养基（PDA）的500 mL锥形瓶中（每瓶200 mL）发酵，在28℃的温度下，置于摇床上以120 r/min的转速培养120 h。初筛时发酵液50 mL，冷冻干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，离心，取上层有机相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作为活性跟踪半制备样品。向大量发酵的5 L发酵液中加入5 L乙酸乙酯，搅拌提取3次，合并提取液过滤后真空浓缩得到提取物1.2 g。

1.2.2 代谢产物的分离纯化 大量发酵的乙酸乙酯提取物用少量甲醇溶解，经硅胶柱色谱进行柱层析，用石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，洗脱组分通过HPLC检测合并为12段（Fr.1至Fr.12）。根据HPLC检测分析结果，应用制备液相色谱对组分Fr.4至Fr.8进行进一步分离纯化，色谱柱为Waters Sunfire prep C18OBD柱（19 mm×250 mm，5 μm），流速为24 mL/min，洗脱梯度33 min（梯度为20%～100%乙腈），由Fr.4分离到化合物1（5.65 mg）和化合物2（12.88 mg），由Fr.5获得化合物3（10.54 mg），由Fr.6获得化合物4（8.22 mg），由Fr.7获得化合物5（20.67 mg），由Fr.8获得化合物6（2.27 mg），其结构如图1所示。

图1 化合物结构

1.2.3 生物活性测定 药物最小抑菌浓度（MIC）的测定采用美国临床和实验室标准协会（CLSI 2012）推荐的微量肉汤稀释法进行。将纯化的细菌划线接种于LB或TSA固体培养基上，37℃培养24 h，挑取单菌落接种于LB或TSB液体培养基中，于37℃、200 r/min摇床振荡培养12 h。将菌液按1∶1 000的比例接种于LB或TSB液体培养基，于37℃、200 r/min摇床振荡培养至OD600nm约为0.5（菌量约为1×108CFU/mL），再将菌悬液1∶100稀释后备用。在96孔培养板中每孔加入50 μL倍比稀释不同浓度的药物，加入50 μL稀释的菌液，每种药物每株菌3次重复，同时设阴性对照和阳性对照。对照药物选择青霉素、链霉素置于37℃温箱中孵育16～20 h，读取结果。肉眼观察微量稀释孔中以无细菌生长现象的最高药物稀释浓度为该药物对该种细菌的药物最小抑菌浓度。平行操作3次，以3次结果的平均值作为此药对该细菌的MIC。

抗真菌活性测试采用96孔盘法［9］，将化合物1至化合物6配制成100 μg/mL的溶液。同时提前准备好指示菌及琼脂培养基的混合物（指示菌的浓度约为1×107CFU/mL），在无菌96孔板中，每孔加入待测样品10 μL，加入培养基与指示菌的混合物90 μL，混合均匀，每样品重复3孔，培养4 d后检查结果。活性分级评价指标：采用目测分级法进行，按3、5、7、9分级记录菌丝生长的密度。各级数具体指标以标准样品药效为基准确定。3表示对病原真菌菌丝无抑制作用，与加入溶剂空白对照组的病原真菌菌丝生长一致；5表示靶标菌丝部分生长；7表示靶标菌丝少量生长；9表示抑菌率为100%，指示病原真菌无菌丝生长。阳性对照为春雷·王铜稀释500倍溶液。

化合物1至化合物6对蚜虫的杀虫活性采用浸叶法［10］。每种化合物用0.1%吐温-80乙醇溶液制备成5种浓度梯度（1 000、500、250、125、62.5 μg/mL）。在实验室条件下，将带蚜虫大豆幼苗浸入不同浓度的供试样品溶液5 s，吸取多余的溶液，然后置于室温培养。每种处理重复3次，72 h后，与阴性对照和85%阿维菌素阳性对照比较，观察死亡率。然后计算致死浓度50%（LC50）。

2 结果与分析

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末，分子式为C18H18O8，相对分子质量为362.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.75（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），6.74（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.31（1H，br s，H-3），5.62（1H，br s，H-5），3.76（3H，s，H-8），3.69（3H，s，H-9＇），3.61（3H，s，H-8＇），2.06（3H，s，H-9＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：167.0（s，C-7），165.3（s，C-3＇），157.0（s，C-6），156.4（s，C-2），155.1（s，C-6＇），153.4（s，C-5＇），140.2（s，C-4），133.7（s，C-3＇），125.6（s，C-1＇），109.5（d，C-3），107.5（d，C-2＇），107.2（s，C-1），104.8（d，C-4＇），104.3（d，C-5），56.0（q，C-9＇），52.0（q，C-8＇），51.9（q，C-8），21.4（q，C-9）。以上核磁数据与文献［11］报道的methyl asterric acid的核磁数据基本一致，确定该化合物为methyl asterric acid。

化合物2：淡黄色粉末，分子式为C18H16Cl2O8，相对分子质量为430.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.76（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.66（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），3.64（3H，s，H-8），3.60（3H，s，H-9＇），3.27（3H，s，H-8），2.45（3H，s，H-9）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：164.5（s，C-7＇），163.8（s，C-7），154.7（s，C-6＇），152.9（s，C-5＇），149.2（s，C-2），149.0（s，C-6），135.7（s，C-4），135.1（s，C-3＇），124.4（s，C-1＇），115.6（d，C-3），115.5（d，C-5），112.5（s，C-1），107.4（d，C-2＇），104.7（d，C-4＇），56.1（q，C-9＇），52.0（q，C-8），51.9（q，C-8＇），18.2（q，C-9）。以上核磁数据与文献［11］报道的methyl 3，5-dichloroasterric acid的核磁数据基本一致，确定该化合物为methyl 3，5-dichloroasterric acid。

化合物3：淡黄色针状结晶，分子式为C17H16O7，ESI-MS（m/z）阴离子：331.1［M-H］-，相对分子质量为332.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.43（2H，br s，2＇，6＇-OH），9.98（1H，br s，4-OH），6.90（1H，d，J=2.1 Hz，3-H），6.67（1H，d，J=2.2 Hz，5-H），6.08（2H，br s，3＇5＇-H），3.64（3H，s，7-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.15（3H，s，7’-CH3）；13C NMR（DMSOd6，125 MHz）δ：199.6（s，C-10），165.6（s，C-8），161.6（s，C-2＇），161.6（s，C-6＇），158.1（s，C-4），156.8（s，C-6），147.2（s，C-4＇），127.9（s，C-2），126.2（s，C-1），109.1（s，C-1＇），107.6（d，C-5＇），107.2（d，C-3＇），107.2（d，C-3），103.4（d，C-5），56.0（q，C-7），52.1（q，C-9），21.6（q，C-7＇）。以上核磁数据与文献［11，12］报道的sulochrin的核磁数据基本一致，确定该化合物为sulochrin。

化合物4：淡黄色针状结晶，分子式为C17H16ClO7，ESI-MS（m/z）：365.4/367.4［M-H］-，相对分子质量为366.4；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.37（1H，s，OH-6＇），10.45（1H，s，OH-2＇），10.07（1H，s，OH-4），6.91（1H，d，J=2.1 Hz，H-3＇），6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.20（1H，s，H-5＇），3.65（3H，s，H-7），3.65（3H，s，H-9），2.24（3H，s，H-7＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.0（s，C-10），165.6（s，C-8），158.5（s，C-2＇），158.4（s，C-6＇），158.2（s，C-4），156.8（s，C-6），144.6（s，C-4＇），128.0（s，C-2），125.5（s，C-1），110.4（s，C-3＇），110.0（s，C-1＇），108.5（d，C-5＇），107.3（d，C-3＇），103.5（d，C-5），56.0（q，C-7），52.2（q，C-9），20.6（q，C-7＇）。以上核磁数据与文献［13］报道的monochlorsulochrin的核磁数据基本一致，确定该化合物为monochlorsulochrin。

化合物5：黄色固体，分子式为C17H14Cl2O6，ESIMS（m/z）：399.0（［M-H］-），分子量为400.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.75（1H，br s，OH-2），11.75（1H，br s，OH-6），10.14（1H，s，OH-11），6.93（1H，d，J=2.1 Hz，H-10），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-12），3.67（3H，s，H-17），3.66（3H，s，H-16），2.24（3H，s，H-14）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.3（s，C-7），165.7（s，C-15），158.7（s，C-11），156.8（s，C-13），155.2（s，C-6），141.8（s，C-4），128.0（s，C-9），125.4（s，C-8），112.3（s，C-3），112.3（s，C-5），107.5（d，C-10），103.6（d，C-12），56.1（q，C-17），52.3（q，C-16），18.9（q，C-14）。以上核磁数据与文献［14］报道的dihydrogendin的核磁数据基本一致，确定该化合物为dihydrogendin。

化合物6：橙红色无定型固体，分子式为C18H16O6，ESI-MS（m/z）：329.1［M+H］+，相对分子质量 为328.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.23（1H，s，OH-1），7.49（1H，d，J=1.1 Hz，H-4），7.22（1H，d，J=1.7 Hz，H-5），7.15（1H，d，J=1.1 Hz，H-2），6.86（1H，d，J=1.7 Hz，H-7），4.69（1H，d，J=3.6 Hz，OH-2＇），3.91（3H，s，8-OCH3），2.74（1H，dd，J=9.5，3.6 Hz，H-1＇），2.69（1H，dd，J=9.5，5.3 Hz，H-1＇），1.09（3H，d，J=4.4 H-3＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：186.4（s，C-9），182.5（s，C-10），164.5（s，C-6），163.5（s，C-8），161.5（s，C-1），148.6（s，C-6），136.9（s，C-10a），131.8（s，C-4a），124.9（d，C-2），119.7（d，C-4），114.7（s，C-9a），112.7（s，C-8a），107.0（d，C-5），105.0（d，C-7），66.6（q，C-2＇），56.4（q，8-OCH3），45.0（t，C-16），23.5（q，C-3＇）。以上核磁数据与文献［15］报道的penipurdin A的核磁数据基本一致，确定该化合物为penipurdin A。

2.2 抗菌活性

采用微量肉汤稀释法测试化合物1至化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、猪丹毒的活性。结果（表1）表明，化合物1和化合物6对这4种细菌无抑制活性；化合物2仅对金黄色葡萄球菌有微弱的抑制活性，其MIC为200 μg/mL；化合物3、化合物4对猪链球菌的MIC均为200 μg/mL；化合物5对金黄色葡萄球菌和猪链球菌均具有微弱的抑制活性，MIC均为200 μg/mL。

表1 化合物的抑菌活性结果 （单位：μg/mL）

2.3 抗真菌及杀虫活性

96孔盘法抗真菌活性试验结果表明，化合物1至化合物6在浓度为100 μg/mL时，对所测试的6种植物病原真菌并无明显抑制活性。浸叶法杀蚜虫活性测试结果表明，化合物1至化合物6在96 h内均无杀蚜虫活性。

3 讨论

本研究从青霉菌属真菌Penicilliumsp.1502的发酵提取物中分离到methyl asterric acid（1）、methyl 3，5-dichloroasterric acid（2）、sulochrin（3）、monochlorsulochrin（4）、dihydrogendin（5）和penipurdin A（6）共6个化合物。化合物1、化合物2是拥有二苯醚结构asterric acid的衍生物，Lee等［11］研究表明在浓度为3～10 μg/mL时，这些化合物均能显著抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的毛细血管形成，asterric acid衍生物可作为抗血管生成药物用于进一步研究。化合物3、化合物4、化合物5是二苯酮类化合物，来源于曲霉属或者青霉属的发酵液中，表现出广泛的生物活性，如微弱的抗真菌、抗细菌和细胞毒活性［12，16］。此外，Ohashi等［17］研究发现化合物3和化合物4对嗜酸性粒细胞脱颗粒具有较强的抑制活性，其IC50分别为0.1、0.3 μmol/L；尤其是化合物3有望成为抗过敏药物的良好先导化合物。化合物5在cyclophilin A异构酶上的对接和分子动力学模拟试验显示了其作为抗病毒和免疫抑制剂的重要潜在活性［14］。化合物6属于蒽醌类化合物，与penipurdin B同时分离自土壤源的紫青霉菌Penicillium purpurogenumSC0070、penipurdin B对A549、HepG2和Hela 3种癌细胞系展现出一定的活性，然而化合物6（penipurdin A）对这3种细胞系并无细胞毒活性［15］。

在筛选菌时，菌株NH-1502显示了较好的抗菌活性，但是活性测试结果表明仅化合物3、化合物4和化合物5对猪链球菌有微弱的抑菌活性；这有可能是活性化合物未被分离得到，亦可能存在协同增效作用。分析结构特征可以发现，化合物1至化合物5都拥有二苯基，化合物1和化合物2是二苯基直接连在一个氧原子上，属于二苯醚类；化合物3、化合物4、化合物5是二苯基连接在1个酮羰基上，这些结构上的差异可能导致了化合物的活性差异。化合物1至化合物6对被测试的6种病原真菌均无抑制活性；此外其对所测试的豆蚜也无毒杀活性。后期将继续对青霉属真菌Penicilliumsp.1502产生的次级代谢产物生物活性进行进一步研究，以期为青霉属来源的次级代谢产物在农用方面的研究提供依据。