基于蛋白质-酚互作体系的核桃仁涩味评定方法

王若辉，李庆杨，刘毅华，莫润宏*

1(中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州，311400)2(南京林业大学 林学院，江苏 南京，210037)

酚类物质是植物的重要次生代谢产物，具有良好的抗菌、消炎和神经保护作用[1]，还能够改善血脂状况，降低冠心病和心脏病的风险[2]，但其也是食物涩味的重要来源。涩味是由于酚类物质苯环上的酚羟基与口腔内的唾液蛋白发生反应，触觉机械感受器感觉到后，由三叉神经的游离神经末梢传导刺激神经，从而产生涩感[3-4]。轻度的涩味会在一定程度上丰富食物的口感，而重度的涩味往往会引起食用者的不适[5]。因此，通过研究涩味的产生和强弱对改善产品口感，增强产品市场竞争力有重要意义，同时可以通过市场认可度来倒逼品种选育和生产加工向“轻涩”、“适涩”方向研究。

核桃仁中的酚主要分布在内种皮上，虽然其在一定程度上能阻止核桃仁的酸败氧化[6]，但也是核桃仁涩味的主要来源[7]。已有学者对核桃中酚类物质代谢途径[8]、核桃内种皮涩味形成的标志物[9]、关键涩味物质[10]等方面进行了研究，并且证实了不同品种核桃间的苦涩味物质具有差异[7]。现有研究虽初步分析了核桃中涩味物质的代谢合成途径、种类和结构等，但对核桃仁涩味评定方法仍停留在感官评审法，该法易受主观感受、个体差异、环境因子等因素的影响[11]，且随着反复品尝易产生“感受疲劳”[3]。另外，电子舌[12]虽然能克服传统感官评审的缺点，但其无法测定滋味物质在口腔中的释放和持久性[13]。因此，学界近年开始利用体外蛋白质[牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)等模拟唾液蛋白]与酚类物质在非竞争体系下相互作用的非感官评定法对涩味进行定量和机理的研究，该体系下蛋白质与酚类物质直接反应后，通过蛋白的减少量来反映涩味的强弱[14-16]。例如，在不同葡萄酒的蛋白-酚的互作模型中，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱法，并根据它们与BSA相互作用的强度来反映不同葡萄酒的涩味程度[15]；也有学者利用紫外-可见分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry, UV-vis)[16]成功鉴定了大批量的葡萄酒涩味程度。而有关竞争体系下蛋白质和小分子互作反应的相关研究也已应运至食品过敏原检测方面[17]。目前，有关非竞争体系中蛋白质-酚类物质互作多见于葡萄酒等液体饮品上的涩味评定，未见其在核桃涩味评定中应用，更未见竞争体系在涩味评定中的相关报道。综上所述，本研究根据涩感产生的原理建立了核桃仁内种皮的体外蛋白质-酚类物质互作定量评定方法，探索了非竞争体系/竞争体系中紫外分光光度法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法对固态样品核桃仁涩味评定的适应性。研究结果可为核桃及其他干果涩味程度的定量评定提供参考，也为核桃品种选育和副产品加工改良等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用核桃样品采自中国北方地区核桃圃。选取树龄一致、长势良好、产量稳定的不同品种核桃植株，每个品种随机采取核桃果实50个，果实大小基本一致且饱满。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均为色谱纯)，德国Merck公司；丙酮、无水乙醇、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠、三氟乙酸(AR)，国药集团化学试剂有限公司；单宁酸(AR)，美国SUPELCO公司；BSA，美国Genview公司。

1.2 仪器与设备

CPA225D十万分位分析天平，德国Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超声波水浴，宁波新芝生物科技公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；R-3旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；UV-3210PC紫外可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；Free Zone 6 L真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；Agilent 1290高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)，美国Agilent公司；Biofuge Stratos高速冷冻离心机，美国Therm公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

采收后的核桃鲜样人工去青皮得到核桃仁，分离内种皮和种仁。将内种皮冷冻干燥24 h后，称取0.5 g 于50 mL离心管中，加70%(体积分数)丙酮水溶液15 mL，均质后超声提取30 min，8 000 r/min离心5 min，取上层提取液，重复3次，合并上层提取液。旋转蒸发掉合并提取液中的丙酮，用2 mol/L的盐酸调节剩余液体pH值至2.0，用15 mL乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去乙酸乙酯，用10 mL甲醇定容，得到核桃仁内种皮的提取液。

1.3.2 感官评审

根据已有文献[18]，由3～5名身体健康、富有感官评审经验的评审人员组成感官评审小组，对核桃样品进行涩味感官评定。评审人员统一在上午10∶00进行核桃涩味评定，评审前2 h不进食。评审员品尝后进行打分(1～10分)，样品涩感越强，分数越高。将3位评审员的感官涩味评分取平均，对核桃样品进行高(G,7.1～10分)、中(Z,4.3～7.0分)、低(D,1～4.2分)涩味程度划分，结果如表1所示。

1.3.3 紫外法对核桃涩味定量评定

1.3.3.1 单宁酸标准曲线的建立

取5.7 mL冰醋酸，加水定容至1 000 mL，用0.8 mol/mL氢氧化钠将pH调至5，制备得到100 mol/mL醋酸缓冲液。用醋酸缓冲液分别配制7个浓度梯度的BSA溶液和单宁酸溶液，即0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL和0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的反应液。随后将单宁酸溶液和BSA溶液均取1 mL按梯度混合，涡旋10 s，在37 ℃条件下水浴2 h，取出后12 000 r/min离心10 min。取离心后上清液1 mL，用醋酸缓冲液1∶1(体积比)稀释，摇匀后静置10 min，在320 nm处测吸光值。固定单宁酸浓度，用该浓度下的BSA浓度梯度的吸光值作图，获得对数曲线斜率绝对值。再用单宁酸浓度梯度与该浓度下对数曲线斜率绝对值作图，得到单宁酸标准曲线。

表1 不同品种核桃的涩味感官评分Table 1 The sensory astringency scores in different varieties of walnuts

1.3.3.2 非竞争体系中样品涩味程度测定

分别取样品加样体积梯度10、20、30、40、50、60 μL至2 mL离心管中，氮气吹干后加1 mL醋酸缓冲液混匀。随后将样品与BSA溶液按梯度混合，按1.3.3.1余下步骤得到吸光值，确定样品加样体积，用该加样体积与BSA浓度梯度的吸光值作图，获得对数曲线斜率绝对值。

1.3.3.3 竞争体系中样品涩味程度测定

分别取10、20、30、40、50、60 μL样品提取液到2 mL离心管中，氮气吹干后加1 mL 0.8 mg/mL的单宁酸溶液，涡旋10 s，将单宁酸-样品加样体积溶液梯度分别与0.8 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，涡旋10 s，按1.3.3.1中步骤得到吸光值。1 mL 0.8 mg/mL的单宁酸溶液与1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液反应后的吸光值为0.642，理论竞争体系吸光值为0.642与纯样品加样体积吸光值之和。在BSA-单宁酸-样品提取液竞争反应体系中，单宁酸和样品提取液都能够与BSA结合，但二者与BSA结合能力可能存在差异，因此可能会出现争夺BSA上结合位点的现象，这种争夺能力的强弱可用样品竞争力表示。样品竞争力的计算如公式(1)所示：

样品竞争力(紫外-可见分光光度法)

(1)

1.3.4 HPLC法-核桃涩味定量评定

1.3.4.1 色谱条件

优先在214 nm下测量；使用Zorbax 300SB-C18(9.4 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以溶液A[0.1%的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)超纯水溶液]和溶液B(0.1%的TFA乙腈溶液)为流动相，梯度洗脱。洗脱程序如下：0～6 min，70%降至50%的A相，30%升至50%的B相；6～9 min，50%升至70%的A相，50%降至30%的B相；9～12 min，保持70%的A相，30%的B相。采集时间为12 min，进样量10 μL。

1.3.4.2 非竞争体系中样品涩味程度测定

用醋酸缓冲液将BSA母液稀释得到质量浓度为0.8 mg/mL的BSA反应液，分别取10、20、30、40、50、60 μL样品提取液，将样品加样体积梯度与1 mL 0.8 mg/mL的BSA溶液混合，涡旋10 s，在37 ℃条件下水浴2 h，取出后以转速12 000×g离心10 min。离心后的上清液过膜装瓶，上机测BSA峰面积。峰面积下降率的计算如公式(2)所示：

峰面积下降率/%

(2)

1.3.4.3 竞争体系中样品涩味程度测定

分别取10、20、30、40、50、60 μL样品提取液到2 mL离心管中，氮气吹干后加1 mL 0.8 mg/mL的单宁酸溶液，涡旋10 s，将单宁酸-样品加样体积溶液梯度分别与1 mg/mL 1 mL BSA溶液混合，按1.3.4.2步骤上机测BSA峰面积。1 mL 0.8 mg/mL的单宁酸溶液与1 mL 1 mg/mL的BSA溶液反应后的峰面积为2 260.23，即理论峰面积，样品竞争力的计算如公式(3)所示：

(3)

1.4 数据处理

实验数据用Microsoft Excel 2016进行初步处理，图表采用Microsoft Excel 2016绘制。

2 结果与分析

2.1 紫外-可见分光光度法在样品涩味程度定量评定中的应用

2.1.1 单宁酸标准曲线建立

单宁酸浓度梯度与BSA浓度梯度反应后，吸光值如表2所示。固定单宁酸质量浓度，随着BSA质量浓度的增大，吸光值呈减小趋势，反应液中剩余单宁酸含量也呈减小趋势。但是，当BSA质量浓度为2.4 mg/mL，单宁酸质量浓度为0.1、0.2、0.4 mg/mL以及BSA质量浓度为1.6 mg/mL，单宁酸质量浓度为0.1、0.2 mg/mL时，吸光值会骤然升高，从而出现“翘尾”现象。固定单宁酸浓度，用该浓度下的BSA浓度梯度的吸光值作对数曲线(除去“翘尾点”)，得到其斜率绝对值。再用单宁酸浓度梯度与对应的斜率绝对值作图，得到线性方程：y=0.473 7x+0.011 4，两者的相关性R2达到0.999 6，表明它们呈现较好的线性关系。由此可知，对数曲线斜率的绝对值可以反映单宁酸与BSA的结合能力，即斜率绝对值越大，单宁酸浓度越高，则相对应的涩味就越强。因此，可以用对数曲线的斜率绝对值衡量样品的涩味程度相对强弱。

表2 单宁酸、BSA溶液梯度混合吸光值测定Table 2 The absorbance values of the reaction systems containing different concentrations of tannins and BSA

2.1.2 非竞争体系中样品涩味程度定量评定

如图1所示，随着样品加样体积的增加，G1、Z1对数曲线斜率的绝对值也逐渐增大，即涩味程度增加(去除“增高点”、“翘尾点”)。但是，D1对数曲线斜率的绝对值在30 μL处得到最低值，随后又逐渐增大。当样品加样体积为10、20、30、40 μL时，所得对数曲线斜率的绝对值与感官评审结果不符。只有当加样体积高于50 μL时，对数曲线斜率的绝对值才表现为G1>Z1>D1，与感官评审结果相符。

实际样品测定时，加样体积定为60 μL。随着BSA质量浓度增加，样品的吸光值均在0.2 mg/mL BSA质量浓度处达到最高值，其中G3和Z2吸光值最高，分别为2.068和2.046。去除“增高”点前的数据，得到不同样品的对数曲线斜率绝对值，如表3所示。其中，感评审官高涩味程度的G1、G2、G3样品的斜率绝对值分别为0.423、0.222、0.461，感官评审涩味程度的Z1、Z2、Z3样品的斜率绝对值分别为0.357、0.373、0.308，感官评审低涩味程度的D1、D2、D3样品的斜率绝对值分别为0.224、0.269、0.141。结果表明，对数曲线斜率的绝对值仅能大致将样品分为高、中、低涩味程度三个区间，而无法进一步区分感官评分相近的样品。

图1 紫外-可见分光光度法的非竞争体系-样品加样体积确定Fig.1 The determination of sample volume in non-competitive system of UV-vis

表3 紫外法的非竞争体系-样品斜率绝对值Table 3 The absorbance values and the slope of the logarithmic curve of walnut in non-competitive system of UV

2.1.3 竞争体系中样品涩味程度定量评定

在竞争反应体系中，如图4所示，随着加样体积增多，纯样液梯度、实际竞争体系吸光值、理论竞争体系吸光值均呈线性增加，但样品的竞争力并未随着加样体积的增加而增加，且二者之间线性关系不明显(R2=0.126)。

图2 紫外-可见分光光度法的竞争体系-G1样品竞争力Fig.2 The competitiveness of G1 in competitive system of UV-vis

2.2 HPLC法在样品涩味程度定量评定中的应用

2.2.1 非竞争体系中样品涩味程度定量评定

如图3所示，同一样品中，峰面积下降率随着加样体积的增加而增加，但二者之间不呈线性。当G1、Z1的加样体积为30 μL时，峰面积下降率均为50%左右，随着加样体积增多，其峰面积下降率逐渐趋于饱和(100%)；而对D1而言，加样体积为60 μL时，峰面积下降率仅为44.28%。此外，在各加样体积下，样品峰面积下降率与感官评审结果不相符(30 μL除外)。结果表明，非竞争体系中，由于HPLC法灵敏度较高，很难确定不同样品的加样体积；加样体积梯度与峰面积下降率之间不呈线性增加，无法拟合线性方程。

图3 HPLC法的非竞争体系-样品加样体积确定Fig.3 The determination of sample volume in non-competitive system of HPLC

2.2.1 竞争体系中样品涩味程度定量评定

经计算，样品加样体积梯度和样品竞争力之间呈线性关系，进而根据样品加样体积梯度与其所对应的峰面积下降率进行线性拟合，得到线性方程，G1、Z1、D1样品的分别为y=0.001 8x+0.021 7、y=0.001 6x+0.002、y=0.001 3x-0.032 2，R2分别为0.993、0.994、0.981。再根据线性方程计算50%峰面积下降率所需样品加样体积(IC50)，IC50值越大，样品涩味程度越弱。G1、Z1、D1其IC50值分别为274.57、302.47，406.55。结果表明，采用HPLC法-竞争体系能够将感官评审区别较大的样品区分开。为了进一步验证此法的可行性，对已有的9个样品进行了涩味程度评定，如表4所示，发现感官评分越低，样品IC50值越大。

表4 HPLC法的竞争体系中样品的IC50值Table 4 The IC50values of walnut samples in competitive system of HPLC

3 讨论

3.1 紫外-可见分光光度法-非竞争体系在固态核桃样品中的适应性

已有研究表明，固定单宁酸质量浓度，随着BSA质量溶液浓度升高，BSA-单宁酸结合反应生成的沉淀量也逐渐增加[19]，同时吸光值降低。本研究中，测定单宁酸标准曲线时，当单宁酸质量浓度较低时，会在BSA溶液质量浓度较高点出现吸光值骤然升高的“翘尾”现象。一般而言，蛋白质和单宁酸可以通过氢键、疏水作用力和分子间作用力等相互结合，二者最初结合会形成可溶性的聚集物，而较高质量浓度的单宁酸会促使这些可溶性聚集物进一步结合形成沉淀，要形成最大沉淀量，单宁酸/BSA两者需达到最佳比例[20]。而当BSA质量浓度过高时，蛋白质可能会由于暴露在单宁酸中变性，致使蛋白质结构发生改变[21]，从而对紫外分光光度计所测结果造成干扰，造成“翘尾”现象。

在核桃样品的涩味定量评定时，无论样品加样体积多少，随着BSA质量浓度增加，吸光值会在0.2 mg/mL BSA质量浓度处先达到一个最高值，随后再逐渐下降。此现象可能与提取液中溶剂残留物质有关系。早有学者利用紫外-可见分光光度法对葡萄酒的涩味进行评定，其涩味程度评定结果与感官评审结果基本一致，相关性高达0.91[17]。葡萄酒本身作为一种混合均匀的溶液，无论是感官评审还是仪器评定涩味，都具有优势。本研究中的样品均为固体，非竞争体系仅能将核桃样品按涩味程度大致分为高、中、低三类，而无法准确评定涩味感官评分相近的样品。由此可见，紫外-可见分光光度虽然能够克服主观因素、个体差异、感官疲劳等影响因素，并对核桃样品涩味程度进行大致定量评定。但是在进行大批核桃样品涩味的定量评价时，此法仍存在稳定性差、受外界影响较大等缺陷。

3.2 HPLC法-非竞争体系在固态核桃样品中的适应性

HPLC法能够定量的反映出蛋白质与酚类物质的结合能力，但现有研究多集中于唾液蛋白与单体酚(儿茶素、表儿茶素等)之间的反应[22-23]，并未将其用至实际样品的涩味程度定量评定中。因此，本研究选择固定BSA质量浓度，加入不同体积样品进行反应。结果发现，不同样品对应的BSA峰面积下降率与加样体积间不呈线性关系，并且不同品种核桃的BSA峰面积下降率达到饱和状态时加样体积差距较大。事实上，与纯单宁酸溶液不同，核桃样品提取液是一个相对复杂的混合酚体系，不同品种会造成酚类物质含量及种类差异[10]。而这个混合样品体系中的某2种，甚至多种酚之间可能存在协同效应，促进了与蛋白的相互作用，促使形成更高的不溶性聚集物[24]，从而出现峰面积下降率“骤变”点。此外，蛋白质、酚类物质间相互作用的缔合强度还会随着酚结构的变化而变化[25]。正是不同核桃品种间的差异，会使得峰面积下降率的“骤变点”大不相同，在实际操作过程中不同品种核桃加样体积的确定也更为困难。因此，HPLC法-非竞争体系无法准确且定量评定核桃样品的涩味程度。

3.3 紫外-可见分光光度和HPLC法的竞争体系在固态核桃样品中的适应性比较

多酚类物质与蛋白结合产生涩感的属性十分复杂，不仅易受到自身化学结构和含量的影响，还与二者结合时外部环境条件(温度、pH等因素)密切相关[25]。因此，紫外法和HPLC法的非竞争体系均难以准确测定核桃样品的涩味程度，且HPLC法难以确定样品的加样体积。因此，本实验采用BSA-单宁酸-样品提取液竞争反应体系对样品的涩味程度进行评定。

在竞争体系中，理论上随着样品加样体积增加，样品的竞争力也应增强。但在紫外-可见分光光度法中样品的竞争力并未随着加样体积的增加而增加。因此，用紫外光度计法不能区分竞争体系中不同涩味程度的样品。用HPLC法时，对核桃样品感官评分和IC50值进行线性拟合，如图4所示，得到线性方程：y=-20.089x+357.49，R2=0.935 2。因此，可利用IC50值表示核桃涩味程度，IC50值越大，样品涩味程度越大。结果表明，通过竞争反应体系，能够放大BSA与样品中酚类物质的结合程度，使得峰面积下降率“骤变”现象消失，从而能消除因品种间酚类物质含量、种类不同造成的涩味定量评定结果偏差。

图4 HPLC法的竞争体系中感官评分与IC50值的关系Fig.4 The linear relationship between sensory astringency score of walnut and IC50in competitive system of HPLC

4 结论

本实验通过紫外法、HPLC法对不同涩味程度的固态核桃样品进行了涩味定量评定。在非竞争体系中，紫外法在测定中会出现吸光值“增高点”和“翘尾点”等现象，并仅能根据定量评定结果将其大致分为高、中、低三类，无法进一步对样品进行详细、准确的定量评定；HPLC法在测定中会出现BSA峰面积下降率饱和的现象，大批样品测定时很难确定具体的加样体积，因此增加了样品涩味定量评定的难度，降低了评定的准确度。而在竞争体系中，紫外法中样品的竞争力与加样体积之间不呈线性，因此不适宜用于涩味程度的评定；HPLC法测定时，样品的竞争力与加样体积间不仅呈线性，而且样品感官评分和IC50值呈良好线性(R2=0.935 2)，即IC50值越大，样品涩味程度越大。因此，在HPLC法的竞争反应体系能够克服吸光值“增高点”、“翘尾点”、峰面积下降率骤然饱和等现象，可用于大批量的对核桃样品的涩味定量评定。