基于蛋白质组学探讨仙连解毒方干预小鼠结直肠癌湿热瘀毒证模型的作用靶点及信号通路研究＊

陆思丞，程海波＊＊，余成涛＊＊，沈卫星，徐长亮，谭佳妮，赖岳阳，范旻旻

（1.南京中医药大学第一临床医学院 南京 210023；2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心 南京 210023）

结直肠癌是（colorectal cancer，CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，占全球每年确诊癌症和肿瘤相关死亡人数的近10%[1]，在我国，尽管CRC在诊断、手术治疗、靶向治疗和免疫治疗方面取得了巨大的进步，但由于复发伴远处转移和抗肿瘤药物耐药，CRC发病率和死亡率依然逐年上升[2]。而中医药治疗能较好地改善生活质量，减轻药物不良反应，提高患者免疫功能，延长生存期，具有良好的临床应用前景。国医大师周仲瑛教授“癌毒”病机理论认为，肿瘤的核心病机主要是“痰瘀郁毒”[3]，在肿瘤的早期正盛邪虚，癌毒蕴结，形成肿块，中期以邪胜正伤，晚期以正虚为主，最终步入损途[4]。本团队认为CRC多属本虚标实，其主要病理因素为湿、热、瘀、毒、虚，湿热瘀毒证是结直肠癌的核心证候[5]，清热化湿、祛瘀解毒、健脾益气法是结直肠癌的基本治法，在此治法指导下形成的仙连解毒方（Xian-Lian-Jie-Du Decotion，XLJDD）是岐黄学者程海波教授临床用于治疗CRC湿热瘀毒证的经验方，主要组成有仙鹤草、黄连、炙黄芪、生薏苡仁等，但其机制尚不明确。

蛋白质组学通过比较生物体内或者组织内所有蛋白的差异表达，从蛋白分子水平揭示物质基础和机制，其整体、动态、网络的特点与中医整体观念、中医辨证论治、中药复方多靶点多层次等研究方法不谋而合[6]。本文以结直肠癌湿热瘀毒证小鼠为模型，研究仙连解毒方对结直肠蛋白质组学的影响，从蛋白分子层面探究XLJDD可能的作用机制，从而为仙连解毒方的临床应用提供重要的科学依据。

1 材料

1.1 动物

选用6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠90只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006；南京中医药大学实验动物中心伦理审查通过本次动物实验方案，批准实验号为201911A027；小鼠在室温23-25℃，湿度40-70%条件下于南京中医药大学实验动物中心喂养。自由饮水摄食，适应环境1周后开始实验。

1.2 药物

仙连解毒方中所有药材均购自江苏省中医院，经南京中医药大学邹立思教授鉴定为道地药材，符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。

1.3 仪器

Q ExactiveTM HF-X质 谱 仪（Thermo）、EASYnLCTM 1200纳升级液相色谱仪（Thermo Fisher/LC140）、低温离心机（Thermo/Micro CL21R）、冷冻干燥机（Labogene/Scan Speed 40）、电 泳 仪（Bio-Rad/1645050）、涡旋混合器（SCILOGEX/MX-S）、电泳槽（Bio-Rad）、电子天平（Sartorius/BSA124S）、酶标仪（Thermo/SPARK 10M）、制冰机（Scotsman/AF103）、组织研磨仪（上海净信/24孔）、细胞破碎仪（宁波新芝/JY92-11N）。

1.4 试剂

偶氮甲烷（AOM，Aladdin/A2107153-25 mg）、葡聚糖 硫 酸 钠（DSS，MPBIO/SR01606-500g）、iRT kit（Biognosys）、Bradford蛋白定量试剂盒（碧云天）、二硫苏糖醇（DTT，Sigma/D9163-25G）、碘代乙酰胺（IAM，Sigma/I6125-25G）、十二烷基硫酸钠（SDS，国药）、尿素（国药/10023218）、质谱级胰酶（Promega/V5280）、碳酸氢铵（Sigma/5330050050）、液相色谱级超纯水（Thermo Fisher Chemical/W6-4）、三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB，Sigma/T7408-500ML）、液 相 色 谱 级 乙 腈（Thermo/A955-4）、液相色谱级甲酸（Thermo/A117-50）、丙 酮（北 京 化 工 厂/11241203810051）、氨 水（Sigma/221228-500ML-A）、ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒（Bio-Rad/1633007）、三氟乙酸（TFA，Sigma/T6508-100ML）。

2 方法

2.1 药物制备

XLJDD药材置于清水中室温浸泡2 h。分别用10倍（1∶10，w/v）和8倍（1∶8，w/v）蒸馏水煎煮2 h，煎煮2次，抽滤，浓缩至1.2 g·mL-1，60%乙醇水提醇沉24 h，抽滤、旋去乙醇，浓缩至2 g·mL-1。参考临床常用剂量，根据人与动物给药等效剂量比公式换算小鼠给药量为12.9 g·kg-1。

2.2 动物模型分组及给药

结直肠癌湿热瘀毒证小鼠模型建立参考文献方法[7-8]，以AOM/DSS诱导同时予以高糖高脂饲料（20%蛋白、35%碳水化合物、45%脂肪，江苏省协同医药生物工程有限责任公司）喂养的复合方法构建。小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照（Control）组、模型（Model）组以及仙连解毒方（XLJDD）组，每组30只。Control组小鼠正常饮食，Model组和XLJDD组小鼠予以高脂饲料喂养，小鼠DSS饮水的同时置于造模箱（（33±2）℃，相对湿度（93±2）%），持续8 h，连续7天，每只小鼠每天饮用5 mL的2% DSS溶液，连续饮水14天，此为一个循环，持续三个循环。期间记录小鼠体重变化，造模过程中会出现明显体重阶段性下降，同时观察小鼠肛门处出现充血水肿、甚至出现隆起赘生物为模型成功显著标志。Model组和XLJDD组小鼠腹腔注射AOM（10 mg·kg-1），Control组小鼠注射等体积0.9%氯化钠溶液。DSS饮水后开始XLJDD组小鼠灌胃，每周6次。

2.3 小鼠结直肠组织蛋白质组学检测

2.3.1样品制备

委托北京诺禾致源生物科技有限公司对本次实验样品进行蛋白组学测序分析，组织样品在低温条件下仔细研磨成粉，置于液氮预冷的离心管中，加入适量PASP蛋白裂解液（100 mmol·L-1碳酸氢铵、8 mol·L-1尿素，pH=8），于冰水中超声裂解10 min充分震荡混匀。将样品置于低温离心机中，4℃、12 000 g离心15 min，小心吸取上清，加入浓度10 m mol·L-1二硫苏糖醇于56℃孵育1 h，结束后加入足量碘代乙酰胺，室温避光孵育1 h。加入4倍体积的-20℃预冷丙酮，在-20℃条件下沉淀时间大于2 h，样品4℃、12 000 g离心15 min后收集沉淀。之后加入大约1 mL-20℃预冷丙酮重悬沉淀，4℃、12 000g离心15 min，收集沉淀，晾干沉淀，最终根据沉淀体积加入适量蛋白溶解液（8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1TEAB，pH=8.5）溶解蛋白沉淀，上机备用。

2.3.2数据采集

配制流动相A液（100%水、0.1%甲酸）和B液（80%乙腈、0.1%甲酸）。每个样本取上清4µg，加入iRT试剂0.8µL，之后将每份样品一分为二上机检测。使用EASY-nLCTM 1200纳升级液相色谱仪系统，自制预柱及自制分析柱规格：（4.5 cm×75µm，3µm），（15 cm×150µm，1.9µm）。本 次 研 究 样 品 使 用Q ExactiveTM HF-X质谱仪，Nanospray Flex™（ESI）离子源，离子喷雾电压为2.1 kV，离子传输管温度为320℃，采用非数据依赖型采集模式（DIA），质谱全扫描范围：m/z 350-1500，一级质谱分辨率：60000（200 m/z），C-trap最大容量：5×105，C-trap最大注入时间：20 ms；二级质谱检测由高能碰撞裂解方法破碎进行，二级质谱分辨率：30000（200 m/z），C-trap最大容量：1×106，肽段碎裂碰撞能量设为27%。

2.3.3数据分析

使用搜库软件Proteome Discoverer 2.2（PD2.2，Thermo）定性蛋白，之后将鉴定结果导入Spectronaut（version 14.0，Biognosys）软件生成谱图库。用T-test检验对蛋白质定量结果进行统计分析，实验组和对照组相比P≤0.05且Fold change≥1.5为上调差异表达，P≤0.05且Fold change≤0.67为下调差异表达。针对差异表达蛋白，使用interproscan软件进行GO和IPR功能注释，COG和KEGG进行蛋白家族及通路分析，最后使用STRING DB软件预测可能的蛋白质-蛋白质相互作用。

3 结果

3.1 小鼠结直肠癌组织蛋白数据质量评价

通过DIA采集各组样品中的蛋白信息并定量分析，结果显示样品中检测的肽段大小分布在7-25之间（图1A），并且母离子质量容差分布显示峰型集中在0附近，表明数据质量偏差小（图1B），此次鉴定共得到6855个蛋白数量，蛋白覆盖度分布图显示鉴定所得蛋白的覆盖率均＞1%（图1C），通过以上质控分析，表明此次实验鉴定的蛋白结果具有较好的准确性，数据可信度高。

图1 数据质控情况

3.2 差异蛋白分析

通过设置差异表达倍数（Fold change≥1.5且P≤0.05）或（Fold change≤0.67且P≤0.05）为筛选条件，绘制差异蛋白火山图，其中分别展示上调前5及下调前5的差异表达蛋白情况（表1和表2）。结果显示：模型组（Model）与对照组（Control）相比，共有163个蛋白表达上调和104个蛋白表达下调（图2A）；仙连解毒方组（XLJDD）与Model组相比，共有98个蛋白表达上调和127个蛋白表达下调（图2B）。同时，在Model组和XLJDD组中都有表达差异的蛋白共有33个。其中差异蛋白在Model组中升高，仙连解毒方干预后下调的蛋白共有18个，分别是：免疫球蛋白kappa4-80（IGKV4-80）、免疫球蛋白重常数3（IGHG3）、免疫球蛋白重变量V1-54（IGHV1-54）、鸟苷酸结合蛋白6（GBP6）、包膜表面糖蛋白（ENV）、TRAF2和NCK相互作 用 激 酶（TNIK）、胶 原 蛋 白XIV阿 尔 法1型（COL14A1）、磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶（PIKFYVE）、酶动力蛋白3（DNM3）、c型凝集素结构域家族2成员d（CLEC2D）、分选连接蛋白7（SNX7）、犰狳重复包含8（ARMC8）、锚蛋白重复序列和锌指结构域包含1（ANKZF1）、Ig kappa chain V-III region PC 6684、甘露糖乙酰葡糖胺转移酶（MGAT5）、干扰素伽玛诱导蛋白47（IFI47）、乙酰转移酶80（NAA80）和WW包含螺旋适配器结合域（WAC）；在Model组中降低，仙连解毒方干预后上调的蛋白共有12个，主要是后期促进复合亚基5（ANAPC5）、死亡因子4蛋白（MORF4l2）、过氧化物酶体生物发生因子5（PEX5）、UBX结构域蛋白7（UBXN7）、二磷酸果糖酶C蛋白（ALDOC）、腭心面综合征中缺失犰狳重复基因（ARVCF）、岩藻糖转移酶4（FUT4）、醣脂类转运蛋白（GLTP）、溶质载体家族30成员9蛋白（SLC30A9）、凝集素半乳糖结合可溶性蛋白12（LGALS12）、细胞色素C氧化酶组装因子7（COA7）和泛素氧化还原酶复合装配因子4（NDUFAF4）。

表1 差异表达蛋白TOP10（Model组VS Control组）

表2 差异表达蛋白TOP10（XLJDD组VS Model组）

图2 差异蛋白火山图

3.3 GO分析

将所有获得的差异蛋白与Gene Ontology数据库中的条目进行比对，计算每个条目中所占蛋白质数目，找出本实验中差异蛋白所显著富集的条目，从细胞组分生物学过程、分子功能、细胞组成3个层次进行GO注释后富集分析，绘制GO富集柱状图。结果显示：Model组与Control组相比，在生物过程中，差异蛋白主要富集在脂质代谢、小分子生物合成和脂质合成等，在细胞组分中，差异蛋白主要富集在细胞外区域和细胞周围等，在分子功能中，差异蛋白显著富集在转移酶活性、受体结合等（图3A）；类似地，XLJDD组与Model组相比，在生物过程中，差异蛋白主要富集在染色质组织、多肽信号过程、抗原准备与合成、蛋白-DNA复合物组装等，在细胞组分中，差异蛋白高度富集在细胞浆膜中，在分子功能中，差异蛋白显著富集在碳水化合物结合、转移酶活性、钙离子通道活性等（图3B）。

图3 差异蛋白GO分析富集柱状图

3.4 KEGG富集分析

KEGG富集分析是基于KEGG Pathway数据库（www.kegg.jp/kegepathway.html）以KEGG pathway为单位，将筛选的差异蛋白进行KEGG注释，通过显著性富集分析判断确定差异蛋白参与相关的信号转导途径。结果显示：Model组与Control组相比，差异蛋白富集在补体系统、蛋白消化吸收和细胞色素P450代谢等通路（图4A），造模后经仙连解毒方干预的通路显著富集在Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化和细胞衰老等通路（图4B）。

图4 差异蛋白KEGG富集气泡图

3.5 PPI蛋白网络分析

进一步利用StringDB数据库（http://string-db.org/）对富集通路中的差异蛋白互作分析，构建蛋白相互作用网络图，发现湿热瘀毒证结直肠癌发生发展的关键节点（图5A）以及仙连解毒方药物干预作用的关键节点（图5B）。从蛋白互作网络分析发现，仙连解毒方影响的差异蛋白互作网络涉及到离子通道、细胞粘附、能量代谢等生物学进程。PPI分析发现PIKFYVE（D3Z5N5）磷酸肌醇激酶在模型组中显著上调，仙连解毒方干预后显著下调，并且与PI4K2A（Q2TBE6）有着相互关系。磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶（PIKFYVE）作为重要的核内体和溶酶体的调节器，调控细胞内环境稳态，而磷脂酰肌醇4-激酶2α（PI4K2A）是一种在细胞内吞作用、高尔基功能、蛋白质分类和膜运输中起重要作用的脂质，提示仙连解毒方可能通过调节磷酸肌酐干预结直肠癌湿热瘀毒证。

图5 差异蛋白互作分析图

4 讨论

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展过程中包括组织学、形态学和遗传学等多步骤参与[9]。炎症是CRC的主要诱因之一[10]，国医大师周仲瑛教授的“癌毒”理论阐明肠癌的基本病机是脏腑功能失调、气血郁滞，夹杂痰湿、瘀血等多种病理因素，受外感毒邪、饮食、情志等内外因素诱导形成癌毒与痰瘀互相搏结于肠道，形成癌肿。因此确立主要治疗原则为“抗癌解毒、化湿泄浊、祛瘀通腑、扶正培本”[11]。在此治则指导下，岐黄学者程海波教授通过长期临床实践形成治疗晚期结直肠癌湿热瘀毒证的临床验方-仙连解毒方，方中以抗癌解毒为核心，清热、化湿、祛瘀为重点，健脾益气为根本。

本文通过AOM/DSS诱导小鼠CRC同时加以高糖高脂饮食构建CRC湿热瘀毒证小鼠模型，基于DIA的蛋白质组学方法进行质谱数据采集，从蛋白质组学层面探讨仙连解毒方干预CRC湿热瘀毒证的潜在生物学机制。蛋白组学结果显示仙连解毒方干预后共涉及到225个差异蛋白，富集分析发现仙连解毒方的干预机制主要集中在Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化、细胞衰老和能量代谢等通路。其中，Th1/Th2以及Th17作为T细胞的辅助细胞，参与调控机体的免疫反应。仙连解毒方干预后，KEGG分析显示Th1/Th2细胞分化以及Th17信号通路均显著富集。研究显示Th1/Th2以及Th17与结直肠临床预后密切相关[12]；在AOM/DSS结直肠小鼠模型中，白藜芦醇通过改变肠道菌群调控短链脂肪酸以显著降低Th1和Th17细胞数量，从而抑制结直肠癌的发展[13]。GBP6是鸟苷酸结合蛋白家族的一员，介导经典与非经典炎症激活途径，诱导自噬和控制囊泡运输，其甲基化与胃癌复发、TNM分期和生存预测有相关性[14]。结果显示，在Model组中GBP6表达上调，经仙连解毒方干预后GBP6表达显著下调，表明其可能是仙连解毒方调控靶点之一。相似地，TNIK激酶也是在Model组中蛋白表达升高后仙连解毒方干预后表达下调，而已有研究报道TINK缺陷小鼠对AOM诱导的结直肠癌具有抗性[15]，而黄连的有效成分药根碱能靶向TNIK蛋白介导的Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌转移[16]。MGAT5即N-乙酰葡糖胺基转移酶5参是一个重要的肿瘤发生和转移相关酶[17]，上调MGAT5表达导致细胞-细胞和细胞-基质粘附降低，并促进运动和侵袭性[18]，而仙连解毒方能显著下调其蛋白表达。值得注意的是，PPI蛋白网络分析筛选出的节点蛋白显示，PIKFYVE即磷酸肌醇激酶是重要的节点蛋白，其被广泛报道作为小分子抑制剂靶点发挥肿瘤治疗作用[19]，其也被证明能选择性抑制免疫细胞产生IL-12/IL-23[20]，涉及包括MAPK、WNT、AKT通路等发挥调控细胞自噬、凋亡等生物学进程。

综上所述，此次研究通过运用蛋白质组学研究方法，通过信息分析技术发现仙连解毒方干预CRC湿热瘀毒证的差异表达蛋白主要富集在Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化、细胞衰老等重要的生物学途径，其中GBP6、TNIK、MGAT5、PIKFYVE等蛋白可能是仙连解毒方作用的潜在靶点，可通过炎症反应、免疫调节等方面发挥治疗CRC作用，对临床治疗有重要的指导意义，阐述复方中药的作用机理。然而，仅通过蛋白质组学的分析结果较为片面，虽然有一些结果与文献报道相似，但是为了更加全面的分析仙连解毒方对CRC湿热瘀毒证的作用靶点，我们后续将利用液-质联用分析技术，转录组学、单细胞组学等多组学研究方式结合，并且验证筛选出的效应蛋白，多角度诠释仙连解毒方的作用机制。