竹类植物种质资源鉴定技术研究进展

汪之波，许 涛，李晓鸿

(天水师范学院生物工程与技术学院/甘肃省农业固体废弃物资源化利用重点实验室，甘肃 天水 741001)

竹类植物是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)的统称。全世界的竹类植物有107属1 300多种[1]，在非洲、亚洲、拉丁美洲等水。热条件较好并受季风气候影响的热带、亚热带地区广泛分布，亚洲是竹类植物的分布中心[2]我国拥有丰富的竹类植物资源，含 34 属 534 余种(含变种)[3]。从竹类的种类、面积、蓄积等方面我国均居世界首位，其中以江西、福建、湖南、浙江4个省最多，分布面积占全国竹林总面积的 60.7%。

竹子开花周期长，很难采集到经典分类学鉴定所需要的花，因此其种质资源的鉴定长期以来是分类学中的难点问题。随着现代技术的发展，植物种质鉴定分析技术不断出现。笔者在查阅国内外竹类种质资源鉴定资料的基础上，整理了学者们在竹类研究方面所运用的各类鉴定方法，并介绍了每类鉴定方法的优点及存在的不足，希望为今后竹类植物种质资源鉴定提供借鉴，也为竹类植物资源的保护和可持续利用提供依据。

1 分类与鉴定

1.1 形态学分类法

1.1.1以生殖体(花果形态和花序)为主要分类依据 目前以生殖体分类鉴定的主要有两类：一类是以花部结构和果实类型为依据的分类系统，主要有：①Munro系统：Munro将全世界竹类植物21属170种分为Arundinarieae、Bambuseae和Bacciferae 3类，前两类为木本竹类，后一类为草本竹类[4]；②Bentham系统：Bentham将竹类植物分为北美箭竹族、牡竹族、赤竹亚族和梨竹族4个亚族；③E. G. Camus系统； Hohtum根据子房解剖结构竹类分为思劳竹型、刺竹与牡竹型、锐药竹型和北美箭竹型4个类型[5]。

另一类是以真假花序为依据的分类。如耿以礼根据花序类型把我国竹类20属71种分为箭竹系和刺竹系；根据花序位置把箭竹系分为箭竹亚族和苦竹亚族，把刺竹系依据果实性状、小穗含花数目等一系列特征分为簕竹族、梨竹族、牡竹族和刚竹族[6]。后来耿伯介在1996版的修订系统中又将中国竹类植物分为2超族6族5亚族37属[7]。

1.1.2以营养体(根茎)为主要分类依据 竹类植物很少开花，一旦开花便会造成整片竹林死亡，因此以花果为依据的分类鉴定非常困难，偏差也较大。所以植物学家更多选择营养体来做分类研究，主要是以地下茎、秆箨及维管束解剖结构等特征来鉴定竹种。耿伯介等研究了竹类地下茎，有合轴丛生、合轴散生、复轴混生、单轴散生4种类型，是分属的依据；秆箨的箨鞘和箨片的形态与习性也是重要的竹种鉴定特征；秆维管束通常有断腰型或双断腰型、紧腰型和开放型，通过对维管束解剖可对竹种进行鉴别[8]。通过此类特征，耿伯介等制定了中国竹类营养体分属检索表。王正平以竹类地下茎、枝、芽、秆箨等为依据，把我国竹类分为4族8亚族，相比于耿式系统取消了超族这一分类等级[9]；丁雨龙等提出竹叶解剖结构也可为竹子分类提供基础[10]；温太辉等研究了竹类 5 族 21 属 30 种淀粉形态和果实外部形态，为竹属系统分类提供了重要参考[11]。

由于竹类少开花，大多营养体特征不稳定且易变，又加之学者们对于竹种分类标准不同，许多竹类的归属都存在争议，就连一些常见种也常出现在不同归属位置，因此仅靠利用形态特征来进行竹种鉴定困难重重，也很容易发生分类上的混乱[12]。为了更好地对竹种进行鉴定，利用现代分类技术就显得很有必要。

1.2 现代分类技术

1.2.1细胞分类学方法 国内外现有200多种竹子进行过细胞学研究[13]。一部分学者研究认为，散生竹的染色体数目为48，丛生竹的染色体数目为72，且认为竹类是以染色体基数X=12的六倍体或四倍体。方伟等对10种散生竹的染色体进行研究，结果表明散生竹染色体数目大多数 为48[14]；张光楚等发现部分丛生竹染色体数目变异较大，有48、56、64、70、72、84、96这几种类型[15]；李秀兰等对94种丛生竹的染色体研究表明，虽然其染色体数目不恒定，但有一定规律可循，一般以2n=70±2的形式来表示，同时发现其体细胞在有丝分裂时有染色体着丝粒融合现象[16]，从而导致其染色体数目不稳定。

1.2.2数量分类法 数量分类法对于植物分类非常有用，因与结果的正确性有直接关系，所以在性状选取是否完善和准确方面要求很高[2]。竹类植物在数量分类学方面的研究相对较少。陈守良等利用数量分类法以53个特征性状对中国13属21种散生竹进行分类研究，提出茶秆竹属应该从苦竹亚族中分离出来，并入赤竹亚族，赤竹属和华箬竹属应该归并，短穗竹属、苦竹属以及青篱竹属应独立存在，并说明利用数量分类时要合理选择原始性状[17]；李德铢等选用了60个性状对15种竹子进行了分析，支持广义牡竹属的划分[18]；高智慧等利用Fuzzy聚类分析对17种散生竹的15个维管束特征进行研究，得出与传统分类基本一致的结果[19]；张汉尧等对14个竹种的41个性状(形态标记)进行研究，，在竹种资源的数量分类方面提供了值得借鉴的资料[20]；李林等也使用数量分类对竹类植物的类群关系进行了研究，得到了可信的结果[5]。这些研究表明，数量分类学在竹类植物的属种关系研究中具有较高的价值。

1.2.3生化分析法 生化分析主要是指应用同工酶，同工酶是基因的直接表达产物。目前应用同工酶鉴定种质在禾本科植物中已较为普遍。 如黄敏仁等于1983年对14个竹种进行同工酶分析，支持将刚竹属分为刚竹组、哺鸡竹组和水竹组，同时发现刚竹属的酯酶同工酶(EST)和过氧化物酶同工酶(POD)稳定，且具有显著的种属专一性[21]；袁文海等分析了20种3变种8变型刚竹属的淀粉酶同工酶，指出淀粉酶同工酶在竹种鉴定上具有重要参考价值[22]。李升峰等利用EST和POD对青篱竹族8属16种竹种进行分析，得出POD对营养体特性比较敏感，EST可以很好地反映花部特征，也表明同工酶研究在竹类植物鉴定中较为可靠[23]；1990年，李升峰利用黄酮化合物对散生竹9属18种竹子做了分析研究，结果表明黄酮在散生竹分类方面具有指导意义[24]； 1黄承才等也研究了9 属 27 种散生竹的EST和POD，表明POD谱存在明显的种间差异，因此可以利用酶谱特征及酶谱距离作为竹种鉴定依据，而EST谱种间差异小，不适用于做竹种分类的鉴别特征，但能反映出种间的亲缘关系[25]；方伟等对丛生竹5属28种竹子的谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)进行了研究，发现GOT稳定，可以用于竹种分属鉴定，而且EST 和 POD 种间分化大，可作为种的鉴定依据[26]。

1.2.4DNA分子标记法 分子标记技术是 DNA 水平遗传多态性的直接反映，是继形态学、细胞学、生物化学等之后发展起来的一类新型研究手段。20世纪80年代分子标记已应用于竹类植物研究，通过分析竹种的遗传变异规律，可为竹种鉴定提供科学的理论依据。目前竹类研究中主要使用的有 SSR、RFLP、AFLP和RAPD等分子标记技术[27]。DNA分子标记凭借多态性高、数量多、不受环境与季节条件的限制、不影响目标性状表达、能够鉴别出纯合体和杂合体以及可以提供完整的遗传信息等优势，成为了该领域的研究热点[28]。

(1)SSR标记。SSR标记具有共显性、高多态性、选择性中性和多等位基因的特点，因此在竹种鉴定中常被选用。李淑娴等利用水稻SSR引物对青篱竹属分子系统做了研究，他们将DNA进行随机扩增，得到了一些特异性条带，对青篱竹属相关属及属下一些竹种的关系提供了新的研究结果[29]；对印度箣竹进行基因文库筛选和Southern杂交，将得到了6个SSR引物并对18个竹种进行了扩增分析[30]；为研究澳洲竹种开花现象，设计了9对SSR引物并测序了扩增产物[31]；利用EST-SSR标记对11属的44个竹种间的遗传变异做了检测，将这些竹种分为两类，即丛生竹和散生竹，与形态学根据地下茎合轴与单轴的分类结果一致，之后又将曲竿竹和淡竹从红边竹中检测出来；卢江杰等利用SSR标记对3个散生竹杂交竹种的真伪进行了鉴定[32]。

(2)RFLP标记。RFLP标记目前多用于刚竹属的研究。如应用RFLP标记对刚竹属26种的36个不同基因型进行了遗传变异和分类研究，根据种间亲缘关系远近将它们分为两类，得出与形态学分类中以花序为依据的分类方法相同的结果[33]；在细胞器层面RFLP标记也有应用，如利用15种限制性内切酶研究了亚洲竹亚科16属的叶绿体 DNA，以便确定这些属之间的系统发育关系，最终得出与营养体和雄蕊为分类依据大体一致的分类结果，可见叶绿体DNA在竹类植物系统发育研究很有价值；还有通过对日本刚竹属 13个竹种的线粒体 DNA研究，发现9个种存在明显的多态性，从而证实了这些竹种线粒体 DNA与系统发育的关系[34]。

(3)RAPD标记。方伟等用RAPD标记对不同栽培型的雷竹及其近缘种进行分析，结果表明不同栽培型雷竹之间的亲缘关系密切，且明显聚在一起[35]；吴益民等对凤尾竹、孝顺竹、白绿竹、绿竹4个竹种进行多态性分析，构建了RAPD指纹图谱[36]；师丽华发现利用RAPD标记可以很好地区分毛竹的栽培型与近缘种，从而认为分子标记在今后将成为种内分类的重要工具[37]。余学军等利用RAPD技术区分了绿竹的不同栽培型[38]。杨光耀等分析了几种苦竹的种间遗传相似性，结果表明：宜兴苦竹与苦竹关系密切，不支持形态学分类中将中国苦竹与日本苦竹分为两类[39]。

(4)AFLP标记。AFLP被称为“最有力的分子标记”或“下一代分子标记”[33]，由于可在一次实验中检测多段多态性片段，因而被广泛使用。如根据AFLP产生的特异性条带得出了麻竹属、巨竹属、竹属和泰竹属的15个竹种之间的亲缘关系[40]；还有对15个竹种AFLP多态性进行研究，对不同的竹种进行区分，鉴别了特殊竹种的基因型；通过考察刚竹属竹种之间系统发育关系，得到了大量可用来区别竹种的AFLP标记，并将这些竹种分成了3个大类；运用3对选择性引物组合对日本矮竹进行AFLP研究，鉴定出22个无性系[32]。

1.2.5其他技术 除了上述形态、生化和分子标记技术外，越来越多的其他新技术应用到竹类植物的分类鉴定中，如李伦应用傅里叶变换红外光谱结合主成分分析和聚类分析技术对竹类植物进行分类研究结果表明 FTIR 结合统计分析能够在种水平对部分竹亚科植物鉴别分类[41]。论文作者应用此技术鉴定了华西箭竹、缺苞箭竹、糙花箭竹和巴山木竹，结果很好地映证了形态鉴定的结论。沈逸通过采集青神县竹林湿地的共 17 属 70 种竹类植物叶片，运用多特征融合的竹叶图像处理技术进行分类，表明图像处理技术能为竹亚科植物分类识别提供切实可行的科学依据[42]。

2 问题与展望

由于竹类植物生长发育的特殊性，使得在种属鉴定方面依然面临诸多困难，造成分类上的混乱问题，主要原因在于：①至今尚未建立一个权威的竹类植物分类系统；②学者们对于分属的标准认定不一致，导致重复发表新种的情形较为普遍[12]。因此，在前人研究的基础上，综合多学科、多技术证据，消除属种分类的混乱现象，建立一套科学严谨的竹类植物分类系统将成为今后的重点研究目标。

现代生物技术的发展为竹类植物鉴定与系统学研究提供了丰富的技术手段，特别是分子标记在竹类亲缘关系的鉴定和遗传图谱的构建方面有着巨大的潜力。相对而言SSR标记和AFLP标记在揭示种内遗传变异和亲缘关系上分辨率高、稳定性较好，是比较高效的研究方法。但是仅仅依靠现代生物技术对竹种进行鉴别依然存在费时、费钱等缺陷，但是现代生物技术与传统形态分类方法相比具有高效、可靠、精准等优点。所以以经典的竹类植物鉴定方法为基础，结合现代生物技术特别是基因测序等手段将是今后竹类分类鉴定必然的趋势。