调节性T细胞在烧创伤中的作用研究进展

徐佳敏，刘 富，段德庆综述，张红艳审校

0 引 言

烧创伤是一种可随时随地发生却未被重视的伤害。烧创伤可由摩擦、冷、热、辐射、化学物质或者电造成，但大多数的烧伤是由热液、固体或火引起的[1]。身体在烧伤后产生的一系列反应使其具有独特性：受伤后，全身和局部的应激反应会立即触发，且难以快速恢复。严重的烧创伤会引起一种复杂的反应模式，这种反应模式可在伤后持续数年。通常情况下，身机体在受到创伤后会立即触发炎症反应以促进愈合[2]，然而，在严重烧伤中，炎症进程变得漫长且不受控制，这导致炎症加剧，引起全身分解代谢状态和愈合延迟。这种反应几乎是烧创伤独有的，且与分解代谢、感染、器官衰竭甚至死亡率的增加有关[3-4]。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)作为一类特殊的T淋巴细胞亚群，对维持机体免疫动态平衡发挥着重要作用。近年来，关于Treg在烧创伤中的研究日益增多，尤其在脓毒血症、多器官功能障碍综合征及创面愈合等方面。尽管在动物模型中Treg在烧创伤中作用已逐步得到阐明[5]，然而，这些细胞在人体烧创伤后的作用研究仍处于起步阶段。本文就Treg在烧创伤中的作用研究进展及现状作一综述，旨在深化对Treg的认识，并为烧创伤后的治疗干预开辟新途径和提供新思路。

1 Treg

若干年前，有研究发现动物体内除了含有自身反应性T细胞之外，还存在能够抑制由这些细胞引起的自身免疫的T细胞，这些抑制细胞后来被称之为Treg，CD25被鉴定为该细胞亚群的第一个标志物[6]。自然产生的CD4+Treg细胞主要在胸腺(thymus-derived Treg，tTreg)中发育且依赖于相对较强的T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号，这使得Treg细胞具有丰富的自体抗原识别系统[7]。在外周，Treg可在TGF- β存在时通过TCR刺激幼稚CD4+Foxp3-T细胞产生，被称为外周Treg(peripherally-derived Treg，pTreg)[8]。研究发现，在体外，可通过模拟pTreg生成的体内条件从CD4+Foxp3-中生成Treg(induced Treg，iTreg)[9-10]。此外，根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同，Treg还可分为CD4+CD25+Treg、Tr1和Th3等多种亚型[11]。

叉头样/翼状螺旋转录因子(forkhead box protein P3，Foxp3)是Treg发育、增殖和发挥抑制功能的关键分子，通常被认定是CD4+CD25+Treg最有特异性的标志[12]。研究表明，Treg功能依赖于小鼠和人类的Foxp3表达水平。Foxp3参与构成TCR诱导的转录因子复合物并调节它们的活性，这被认为对于调节 Treg中TCR诱导基因的表达动态至关重要，因为这构成了Treg介导的免疫抑制的主要机制[8,13]。需要特别注意的是，虽然在小鼠中 Foxp3 的表达仅限于Treg，但许多人类 Foxp3+T细胞与常规T细胞 (conventional T cell，Tconv) 的相似度比与Treg更高，并且一些激活的非抑制性 Tconv 表达低水平Foxp3[14]。因此，将 Foxp3 表达与其他 Treg 标记物(CD45RA、CD127(IL-7R)、CD25)结合起来，以便在人类中识别和分析这些细胞是至关重要的[15-16]。

Treg可通过直接作用于效应细胞群或通过调节抗原呈递细胞 (APC) 表型的间接机制来发挥其功能[17]。Jonuleit等[18]发现，tTreg似乎通过细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡受体-1(programmed death receptor -1,PD-1)等受体以依赖性接触的方式对效应T细胞的增殖和功能发挥抑制作用。相比之下，pTreg主要通过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和白介素-10 (interleukin-10，IL-10)等可溶性因子发挥其抑制功能[8]。Treg主要通过三种机制对不同细胞类型发挥抑制作用：①产生可溶性因子，如抗炎细胞因子(IL-10、IL-35 和 TGF-β)、丝聚蛋白-2(filaggrin-2，FLG-2)、腺苷、颗粒酶和穿孔素；②竞争生长因子，Treg上的高亲和力CD25 受体与效应 T 细胞竞争相关配体；③抑制性受体，已观察到 Treg通过 CTLA-4、T细胞免疫球蛋白黏蛋-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, Tim-3)、神经纤毛蛋白-1 (neuropilin-1, NRP-1)、半乳糖凝集素-1 (galectin-1, Gal-1)和淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte-activation gene 3, LAG-3)及其配体的相互作用对靶细胞有直接作用[19]。

2 Treg在烧创伤中的作用

2.1 Treg与脓毒血症脓毒症可造成约50%～60%的烧创伤患者死亡，其主要机制是免疫系统麻痹或免疫瘫痪。严重烧伤感染并发症病理过程中, 机体天然免疫反应障碍被认为是诱发脓毒症的最重要因素之一[20-21]。烧伤后脓毒症对宿主免疫系统的影响是通过多重机制实现的，包括辅助性T细胞稳态失衡，CD4+T 淋巴细胞凋亡增加，Treg凋亡减少及细胞因子谱改变等。

大量资料表明，并发脓毒症或死亡的烧伤患者体内Treg活性增加。MacConmara等[22]对小鼠模型的研究表明，烧伤后Treg数量和活性的上调与抗原呈递和Th1反应被抑制有关，之后Treg消耗可使其恢复。Yamakawa等[23]进一步研究发现，创伤诱导记忆样 Treg 群体的扩张和激活，大量的Treg对创伤反应强烈，可能在胸腺或外周组织的发育过程中获得了直接对损伤作出反应的能力。通过观察小鼠模型，还发现DAMPs或特定的MHCII+APC亚群(如B细胞)可能参与了CD44highTreg的激活。

Tatura等[24]检查了 Foxp3+Treg 细胞与浓度血症早期的相关性，通过实验观察到与未经历Treg耗竭的小鼠相比，Foxp3+Treg的耗竭导致更严重的脓毒血症病程。这一发现表明 Treg在盲肠结扎穿孔模型(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症的早期阶段减弱了过度炎症免疫反应。更进一步的研究发现，在广泛组织损伤期间释放的 IL-33 诱导脓毒症幸存者体内巨噬细胞的 ILC2s 扩张和 M2 极化，可促进伤口愈合过程。然而，IL-33 诱导分泌 IL-10 的 M2 巨噬细胞增加了 Treg 细胞群的扩增，从而导致了长期败血症诱导的免疫抑制的发展[25]。最近有研究者发现，表达T细胞Ig和ITIM结构域受体(T-cell immuno-receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)的Foxp3+Treg细胞在抑制Th1和Th17反应中起着核心作用。此外，TIGIT+Treg亚群也可作为Th2适应性免疫的诱导剂。Mikhael等[5]通过实验发现虽然在脓毒症的急性期观察到TIGIT-Treg细胞的增多，但在脓毒症的晚期只有TIGIT+Treg扩大并保持显著增加，从而证明了CD4+TIGIT+Treg是在脓毒症后阶段增加的Treg的主要亚群。该实验也证明了通过IL-33/ST2/STAT6/M2巨噬细胞对TIGIT+Treg亚群的扩增是与脓毒症免疫抑制状态相关的重要事件。

机体长期存在的Treg导致严重持续免疫反应和与不良预后相关。在脓毒症的发生和发展过程中，始终存在着同时导致炎症反应亢进和免疫功能抑制的双重因素。一般来说，早期以炎症反应亢进为主，中晚期以免疫功能抑制为主，但是这两者的时间区分与界限并不清，而且在整个过程中都会伴随着两者的相互调节与拮抗。大量研究结果发现 Treg在脓毒症中是持续增高的，这种变化可能是机体为了逃避过度的炎症反应引发严重的组织器官损伤的一种自身调节反应，但存在一定的限度[26]。

2.2Treg与多器官功能障碍综合征烧创伤患者存在的过度炎症反应与机体应激性炎症因子过量释放有关，并因此形成炎症级联放大效应，持续存在的过度炎症反应将导致患者出现免疫功能障碍及血管内皮损伤等症状，并可能引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，最终导致患者死亡。

由非炎性抗原引起的全身性的免疫反应称为全身炎症反应综合征(systemic inflammatary response syndrome，SIRS),目前认为SIRS是 MODS 的共同通路，而免疫炎性反应失衡是导致 MODS发生的根本原因。有研究发现在多发创伤患者SIRS诊断成立后的24 h内，Treg比例即有显著升高，并且CD4/CD8明显下降，这提示多发创伤患者早期SIRS过程中Treg比例就升高，并且这种发挥抗炎作用的Treg可通过多种途径抑制机体的细胞免疫状态，导致机体细胞免疫紊乱，表现在细胞增殖能力低下，CD4/CD8的比例失调等[27]。

关于 SIRS/MODS 存在多种动物模型，主要是酵母多糖诱导的全身炎症反应模型(zymosanInducedGeneralInfection，ZIGI)和CLP被广泛运用。ZIGI 模型的病理学改变在时间和程度上都和人类无感染的SIRS 很相似，而 CLP 模型和典型的感染患者的 SIRS相似。有研究证实在 ZIGI模型中Treg产生的抑炎因子IL-10可有效减缓 MODS 的发展，但 Treg在酵母多糖诱导的 SIRS 模型中的作用仍未阐明[28-29]。此外，研究表明，γδT细胞产生的IL-17在SIRS的损伤中产生着重要作用。而γδT细胞可产生一种热不稳定的小分子物质对Treg产生直接抑制作用[30]，因此推测在SIRS模型中γδT细胞对Treg存在直接抑制作用。

Treg作为CD4+T细胞的一个子集，其任务是控制其他Th细胞可能造成的潜在损伤作用[31]。其可通过抑制炎症、使APC失活或阻断常规CD4+和CD8+T细胞的反应性来预防各类炎症疾病。这些细胞在促进烧创伤后SIRS/MODS中的作用正逐渐被强调。

2.3Treg与创面愈合Treg的特殊亚群存在于身体的许多外周(即非淋巴)器官中[32]，这些细胞都是用于减轻过度炎症反应[33]、维持组织稳态和促进器官功能。通常，小鼠和人类皮肤中的 Treg分别占到30-50%和20-30%总CD4+T细胞[34]。伤口愈合是个高度炎症过程，会使得很多循环免疫细胞聚集到受伤组织中。Treg在表皮擦伤或全层损伤后在皮肤中积聚，在受伤后约 1 周达到最大水平[35-36]。当皮肤出现伤口时，某些高表达 CD25、CTLA-4 和共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)的活化Treg 能够抑制伤口中产生干扰素-γ (interferon-gamma, IFN-γ) 的 T 细胞和炎性巨噬细胞。此外，Treg表达大量表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)有助于其组织修复能力[35]。研究者证明皮肤调节性T细胞通过趋化因子17(chemoattractant cytokine ligand 17,CCL17) 和 趋化因子22(chemoattractant cytokine ligand 22, CCL22)与其受体即趋化因子受体4(chemokine receptor 4, CCR4)的相互作用迁移到皮肤，积极修复皮肤损伤组织。其中，CCL17促进血管识别和外展，而CCL22引导随后的皮肤迁移[37-38]。在皮肤伤口引起炎症的情况下，当炎症自发消退，之后任何的抗原表达都可引起微弱且短暂的免疫反应。有进一步的研究表明，上述情况的出现是因为一小部分Treg持续存在于皮肤中，它们表达低水平的CD25，但表达较高的 KLRG1、CTLA4和CD127，类似于记忆 T 细胞[39]。

目前尚不清楚不同来源的Treg之间是否在功能上存在差异。现已明确，募集到受伤肌肉中的Treg 与内脏脂肪组织中的非再循环组织驻留 Treg 具有许多相同的修复转录特征，这表明无论个体发育如何，受伤组织中的 Treg 最终均可实现类似的修复能力[40-41]。有资料表明，组织浸润Treg与组织驻留Treg 之间可能存在时间或空间差异[42]。

对于Treg如何参与创面修复，有实验证明EGFR的配体双调蛋白 (amphiregulin，AREG) 的分泌是包括 GATA-3+Treg在内的许多Ⅱ型免疫细胞共有的组织修复的主要机制[43]。皮肤中的GATA-3+Treg 表达“警报素受体”(如 TSLP、IL-33 和可能的 IL-18)，这些受体在组织损伤时被释放，使它们能够感知局部损伤。其中，IL-18 和IL-33可刺激修复性细胞因子双调蛋白的Treg产生，且与 TCR 刺激无关。除了赋予Treg直接的组织修复功能外，部分GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3, GATA-3)和干扰素调节因子4(interferon regulated factor 4, IRF4)还通过稳定Foxp3的表达来增强适应性 Treg 功能，这些“经典”Treg功能与 TCR 刺激有关[42]。

虽然在伤口愈合过程的早期，炎症对于预防感染是必要的，但过度的炎症对伤口愈合会适得其反。在组织修复的初始阶段，Treg通过减弱过度的Ⅲ型免疫反应在促进正常表皮再生方面发挥间接作用[36]。最近有研究显示，皮肤 Treg 在维持稳态和皮肤纤维化实验模型中可抑制肌成纤维细胞的活化，表明这些细胞可通过在伤口愈合后期抑制Ⅱ型免疫来防止过度瘢痕形成[44]。除此之外，Treg分泌的两种广泛抗炎和高度多效性的细胞因子IL-10 和 TGF-β已被证实广泛参与伤口愈合[45]。

3 结语与展望

综上所述，Treg在烧创伤中具有重要作用，主要体现在对损伤后皮肤的修复和免疫功能的调节等方面。近年来，Treg在不同领域受到广泛关注，研究者对Treg在烧创伤中作用的认识取得了不同程度的进步，但仍有许多重要科学问题亟待深入研究。首先，人类Treg的研究因缺乏将Treg与其他 T 细胞群独特地分离的明确表面标志物而受到阻碍。小鼠与人类之间存在明显差异，在小鼠体内发现的Treg特征是否同样适用于人类仍需大量的临床试验加以验证。其次，创伤激活Treg是有益还是有害，或者调节Treg是否可作为创伤和创伤相关并发症(如机会性感染、全身炎症或器官损伤等)的免疫治疗尚不清楚。此外，脓毒症后Treg 细胞表达增加的影响一直存在争议，因为一些人将其与更糟的预后相关联，而其他人则认为其与更好的预后和免疫力相关，Treg在烧创伤中作用的机制尚未得到充分阐明。目前观察到的IL-33/ST2/STAT6/M2巨噬细胞对TIGIT+Treg亚群的扩增与脓毒症免疫抑制状态相关有望成为临床研究Treg的一个新切入点，进一步明确烧创伤后Treg在人体内的变化及相关作用机制，为烧创伤后的治疗和干预开辟新的途径。