三氧化二砷肾毒性及其防治研究进展

2022-12-29吴志瑰彭财英付小梅

中国药理学通报 2022年2期

阚瑞，钟瑞，刘婧，吴志瑰,2，彭财英，陈鸿，付小梅,2

(1．江西中医药大学药学院，江西南昌 330004；2.范崔生全国名中医传承工作室,江西南昌 330006)

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓细胞白血病的一种特殊类型，致病因素目前尚不明确。病毒、化学毒物、放射、遗传等都可能是APL的致病因子。ATO用于治疗白血病始于18世纪Flower首创的Flower′s液(1%亚砷酸钾)，1931年，外国学者用亚砷酸注射剂治疗慢性粒细胞白血病(CML)。1971年，韩太云偶然发现由中药砒霜、轻粉(氯化亚汞)和蟾酥等配制而成的民间秘方——癌灵注射液可用于治疗癌症。1973年，张亭栋使用癌灵注射液治疗白血病取得良好疗效。2000年，砷剂注射液作为第一个中药抗白血病药物经FDA特批上市。ATO已被证明是治疗APL最有效的单一药物，并且在ATO和全反式维甲酸的共同治疗后，APL患者的长期生存率已改善到80%～90%。在过去的几十年里，临床数据显示使用ATO会导致心毒性、肝毒性和肾毒性[1]，这些不良反应大大限制了ATO的临床使用。

1 不良反应

ATO在治疗APL的过程中发挥着重要作用，但由于ATO本身的毒性，常会伴随着不良反应。临床数据表明，ATO使用后会出现食欲不振、恶心呕吐、关节肌肉疼痛、牙龈出血、脑血管栓塞等不良症状，尤其对心、肝、肾的影响更为显著[2]。甘戈等[3]通过检索1994-2007年的《中国期刊全文数据库》，对收集到的27例ATO严重不良反应的文献报道病例进行统计分析，其中导致心、肝、肾功能衰竭的病例占总病例的23.2%、10.71%、5.38%。并且随着年龄的增长，并发心、肝、肾毒的几率会增加，加重砷积累而引起的疾病。单独使用ATO或与其他药物联用均会引起心、肝、肾毒性。

ATO诱导的心脏毒性具有浓度依懒性，低剂量时细胞凋亡占优势，高剂量会引起细胞坏死。心脏毒性表现为心悸、胸闷等现象，包括窦性心动过速、心律不齐，心电图显示T波改变、ST-T变化、Q-T间期延长、传导阻滞等。

肝脏是ATO主要的代谢器官，在代谢过程中极易对肝功能造成损害。肝毒性主要表现为碱性磷酸酶，血红胆素升高，尿常规异常，黄疸，肝区疼痛等现象。ATO会诱导肾脏产生病变，用药7～8 d可能会出现不同程度的水钠潴留，出现浮肿、胸腔、腹腔积液等现象，严重者会导致肾衰竭。ATO在临床应用中表现出来的毒性反应的特点是作用范围广、安全范围小、剂量不易控制等，严重限制了其在不同年龄段、不同身体状况人群中的使用，因而一定程度上阻碍了砷剂的临床使用。

2 机制

在众多学者的努力下，人们对ATO所产生的肾毒性的作用机制已有了初步的认识，但是其详细的致毒机制还未明确。目前，学者们认为As2O3的致毒机制是多方面的，主要有氧化应激机制、细胞凋亡、DNA甲基化等。

2.1 氧化应激机制氧化应激是As2O3中毒的重要机制之一，研究发现，砷通过干扰机体的氧化从而引发机体的氧化应激反应，损伤DNA修复途径，诱导DNA突变，扰乱DNA修复酶PTMs(转录后修饰酶)，破坏蛋白质酪氨酸磷酸化，导致细胞癌变。脂质过氧化过程中引发的氧化应激机制是砷中毒的主要机制之一。脂质过氧化与中毒、肿瘤等多种疾病有关。在脂质过氧化过程中会产生多种自由基和非自由基产物，可以引起细胞功能紊乱，对机体造成伤害[4]。三价的砷化物通过血液积蓄在体内多个脏器中，并进行了甲基化接着进一步形成以二甲基胂(DMA)为主的多种砷的代谢产物，这些代谢产物增加可以产生多种活性氧(ROS)自由基。另外，DMA还可以先与GSH反应，再与O2反应形成过氧化物和自由基。分布于肾脏中的砷代谢产物都会不同程度引起自由基和过氧化物增多，从而造成氧化损伤。

2.2 诱导细胞凋亡机制As2O3诱导细胞凋亡是其抗癌作用发挥的机制之一，但同时也是其致毒机制之一。砷中毒后，抑制线粒体的呼吸功能，会造成ATP的损失和产生ROS，改变细胞信号的传导和基因的表达，促进细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制细胞增殖[5-6]。研究表明，砷中毒会使肾小管上皮细胞和肾小管肿胀、变性、坏死[7]。半胱氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)是细胞凋亡调控蛋白，在细胞凋亡中末阶段被激活发挥作用，caspase-3的水解底物是天冬氨酸，天冬氨酸被称为细胞凋亡的“执行者”，As2O3与调控caspase-3的基因级联反应有关，导致细胞凋亡，产生肾毒性[8]。

2.3 DNA甲基化机制传统的毒理学认为砷的甲基化是机体内降解砷的主要途径，砷的甲基化可以使机体维持稳定状态，可以阻止致癌原对基因的损伤，后期的研究结果显示，砷的甲基化会对细胞DNA的甲基化产生影响，DNA甲基化会导致SAM缺乏、DNMT(DNA胞嘧啶5-甲基转移酶)基因表达减少，抑制Tet(ten-eleven translocation family enzymes)蛋白以及CTCF(转录因子)在DNMT和TET基因启动子上的异常结合，降低5-hmC(5-羟甲基胞嘧啶)的水平。近年来的研究表明，As2O3的长期使用会使砷在肾脏中积累，并且代谢转化为多种甲基化砷的代谢产物，这些代谢产物会加重致癌原对DNA的损害，导致细胞毒性[9]。

2.4 其他毒性机制

2.4.1影响免疫系统机制 As2O3在应用于治疗白血病过程中，可能会有黏附分子和黏附分子整合素等细胞因子产生，这些细胞因子会使24得白细胞黏附滞留在肺循环中，从而使白细胞从血液渗入肺部器官组织，加重炎症反应[10]。另外，还有研究表明[11]，As2O3可以促进APL细胞分化，从而使白细胞数目迅速增加到之前的几十倍以上，因而可能会导致高白细胞血症。

2.4.2基因组损伤机制亚砷酸盐本身是一种弱致突变剂，已知它能增强其他致癌物的致突变性，这可能是因为它具有抑制这些致癌物引起的DNA损伤修复能力。研究表明，亚砷酸盐通过干扰DNA修复基因的表达水平和DNA修复蛋白的催化活性，影响碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、DSB修复(DNA双链断裂修复)、ICL修复(DNA横向交联修复)、DDR信号(DNA损伤应答信号)、细胞周期检查点调节以及损伤细胞凋亡，这些因素共同削弱DNA的修复能力，损害基因的完整性。As2O3在机体内引起DNA甲基化的改变也会对DNA的修复产生影响。DNA的代谢与DNA的甲基化会使用相同的甲基供体，造成细胞内甲基供体含量降低，导致基因组DNA低甲基化，对基因的表达产生干扰，造成基因异常表达，诱导细胞癌变。最近研究表明，非编码RNA(ncRNA)在表观遗传学中的调控作用越来越重要，ncRNA包括小干涉RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)以及长链非编码RNA(lncRNA)，其中miRNA在砷致癌过程中起重要作用。miR-145可以靶向调控NER基因ERCC1与ERCC2在修复DNA损伤时的作用[12]。

2.4.3组蛋白H4K16乙酰化水平下调机制组蛋白翻译后修饰可以调控大多数与细胞生命进程相关基因的表达，有研究发现，As2O3能够使UROtsa细胞的组蛋白H4K16位赖氨酸乙酰化水平降低，但其组蛋白乙酰转移酶hMOF的表达并未受影响，正常表达的hMOF会形成一个锌指结构，而As2O3会与这个结构上的C2HC部位结合，因而降低了该酶的活性，下调了组蛋白H4K16乙酰化水平，最后产生了细胞毒性。实验中最终也发现，过度表达hMOF可以增强细胞对As2O3的抵抗力，这一结果也可为解决As2O3表观遗传学毒性机制做一参考。

2.4.4微量元素不平衡近期研究发现，硒摄入不足，铜、铬过量，铜锌比高，导致机体内微量元素的不平衡也可能是导致砷中毒的原因之一。在砷化区环境介质中，砷、铜、铬的含量和铜锌比高于正常区域，硒的含量低于正常区域；随着砷中毒程度的加重，砷、铜、铬的含量和铜锌比逐渐升高，硒浓度逐渐降低[13]。

As2O3具有极其广泛的作用范围以及繁杂多样的致毒机制，其复杂的作用机制可能会发生系统、整体间相互作用，而现有研究较多专注于其作用于分子、细胞或少部分组织器官层面，缺乏较为系统和全面的致毒机制研究和分析。

3 ATO肾毒性的防治

通过对砷剂所致心肝肾毒性机制的逐步研究，一些解毒药物也慢慢被发现，药物与砷剂联合治疗APL，减少了不良反应的发生也提高了患者的长期生存率。

3.1 抗氧化剂治疗氧化应激机制是As2O3致毒的主要机制，As2O3所致的心、肝、肾毒性大都是由氧化应激引起，因此抗氧化剂的使用是减轻砷中毒的重要措施。

褪黑素是松果体产生的一种胺类激素，已证明具有抗炎和抗氧化活性。研究表明，褪黑素能够减轻机体内的ROS和RNS水平，提高抗氧化酶的活性，达到治疗砷中毒的目的[14-15]。白藜芦醇是一种多酚类化合物，可以降低血管内皮素诱导的心脏毒性和肾脏毒性。白藜芦醇能够显著清除ROS，抑制血管氧化损伤，并能通过促进血管代谢显著降低肾脏中砷的积累。在使用As2O3前，以白藜芦醇预防其毒性反应，可以有效的减轻其对心脏和肾脏的毒副作用。有研究表明，白藜芦醇可以作用于Nrf2-HO-1通路以及hERG-HSP70/90复合体蛋白，减轻氧化应激对心脏损害以及hERG 钾离子通道异常所引起的心电图异常反应，另外，它还能清除自由基以及减少肝脏部位的砷积累[16]。异甘草酸镁(MgIG)是用碱异构催化从甘草中提取的第四代甘草酸剂，目前它在临床治疗中被用作肝保护剂，MgIG显著激活As2O3介导的肝组织中Keap1和Nrf2的表达。MgIG给药是保护肝脏免受As2O3诱导毒性的有效治疗方法。MgIG能够维持肝脏中的Nrf2水平，保护抗氧化的防御系统，减轻氧化应激，防止As2O3诱导的肝损伤[17]。

3.2 抑制细胞凋亡由线粒体功能障碍而引起的细胞凋亡是砷致毒机制之一，所以解砷毒就需要通过改善线粒体功能而抑制细胞凋亡。研究显示抗坏血酸是临床上使用的治疗砷中毒的另一抗氧化剂，在治疗APL的过程中，使用维生素类药物可以减轻As2O3的毒性。左旋维生素C(L-AA)与As2O3联用可以改变线粒体的功能和结构，恢复ATP酶的活性，减少细胞凋亡比例[18]。研究表明，二硫苏糖醇(DTT)可以消除As2O3对线粒体的影响，防止As2O3诱导的细胞凋亡，使用低浓度的DTT可以减轻砷暴露对人体的影响[19]。

3.3 拮抗砷与巯基结合硒作为人体必需的微量元素，不仅具有维持人体免疫功能、增强代谢解毒和降低心血管疾病发生的作用，还具有拮抗砷、镉、汞、镍等有毒化合物对机体的损伤的作用。砷的致毒机制之一就是砷进入人体后，可与含有巯基的酶结合，影响细胞活性，对体积造成损伤。砷和硒皆可与巯基结合，进行补硒治疗可以拮抗砷与巯基的结合，抑制砷产生毒性，从而起到解毒的作用。

驱砷治疗主要是采用驱砷剂——巯基络合剂进行治疗，驱砷剂中的二巯基与砷结合，解除砷与蛋白质和酶的结合，恢复蛋白质和酶的生理功能，二巯基与砷结合后的产物从尿中排出。二巯基丙磺钠(DMPS)是目前治疗砷中毒的首选药物，其解毒能力强，毒副作用小，同时对铬、毒鼠强等中毒也有解毒作用[20]。驱砷剂经尿排出会加重肾脏的负担，对肾造成损伤，所以，在进行驱砷治疗时结合血液灌注治疗会减轻肾脏的损害。

3.4 增强机体免疫力海尔福口服液是由茯苓、银花、甘草等10种中药经现代方法精制而成的中药制剂，是目前临床上用于治疗砷中毒的主要中药药物。研究表明，海尔福口服液中含有硒元素，并且能够提高机体免疫力，这可能是其治疗砷中毒的主要原因[21]。银杏叶提取物(GBE)中含有银杏黄酮苷类和萜烯内酯类等活性成分，GBE可以提高免疫器官指数和增加T淋巴细胞数量，调节T淋巴细胞亚群平衡，从而增强免疫功能。在燃煤砷中毒的大鼠中，银杏叶能够减轻肾脏损害，改善免疫功能[22]。

3.5 改良药物剂型纳米药物是一种比常规化疗更安全、更有效的癌症治疗方法，特别是肿瘤微环境和正常组织的区别经常被用于刺激反应药物递送系统，以控制治疗药物在靶部位的释放。将As2O3制备为pH敏感型脂质体以及包覆聚丙烯酸，协同递送As2O3以达到治疗效果并且能够减少不良反应对患者身体健康的影响[23]。

亚砷酸持续缓慢静脉输注法是As2O3在应用于治疗白血病时，针对砷剂在体内浓度难以控制，通过多方面科学手段相协调，很大程度解决了砷浓度与细胞分化/凋亡这二者之间不平衡的关系，使得砷剂疗效不减弱的前提下，更加精准的控制了As2O3的释放，大大的减弱了其毒性，减少了APL中高白细胞血症等毒性反应。

3.6 联用As2O3毒性拮抗药物研究者们在As2O3的大量临床实例中发现，其心脏离子通道机制、诱导凋亡机制以及氧化应激机制等给患者带来了大量毒副作用，是影响砷剂应用的主要障碍[24]。

心脏毒性是主要毒性反应之一，当As2O3的心脏离子通道机制被发现后，就尝试把钙通道阻滞剂(如维拉帕米)、钾通道激动剂(苦参碱和氧化苦参碱)、线粒体辅酶(辅酶Q10)等多种心脏保护剂与As2O3联用，并取得了一定进展。

《本草纲目拾遗》中记载：“解吡毒刘霞裳云：凡人食吡垂死者，用南天竹四两，擂水服之立活。此方刘在松江府署亲试验者。无鲜者。即用干子一二两煎汤服，亦可”。南天竹根、茎、叶、果实提取物能够抑制细胞凋亡，南天竹中的总生物碱也被证明能有效降低As2O3对小鼠心脏、肾脏、肝脏的损伤[25]。丹参中的主活性成分之一丹酚酸B也被发现与As2O3联用有增效减毒的奇效。