趋化因子CXC配体1影响人口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移的作用机制

王燕琴 陈刚 杨松 孙盛洋 任秀英 王伟群 曲义坤

(佳木斯大学 1医务处校医院，黑龙江 佳木斯 154007；2附属第一医院；3基础医学院)

头颈部癌是上呼吸道和消化道上皮层最常见的恶性肿瘤，其主要包括鼻咽癌、甲状腺癌、唾液腺癌、口腔癌和喉癌等〔1〕。病理分型显示，头颈部最常见的肿瘤是鳞状细胞癌，约占所有头颈部恶性肿瘤的90%〔2〕。口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，临床上可见于牙龈、颊黏膜、硬腭、嘴唇、舌体等多个器官，具有恶性程度高、快速和无限生长、较易浸润和转移、预后差、危害大等特点〔3,4〕。OSCC可占头颈部癌症的95%左右，并呈现逐年上升趋势，仅过去10年其发病率就增加了50%〔5〕。据统计在2003年OSCC还是全球第八大常见癌症，而到了2016年，其已经上升为全球第六大恶性肿瘤〔6,7〕。1975～1977年，OSCC患者5年相对存活率为52.5%，但在随后的40年中患者每10年的存活率仅增加了2%～3%〔8〕。趋化因子是由机体细胞分泌的一类小的细胞因子信号蛋白家族，其已被认为是在机体免疫监测、发育、炎症和癌症进展等过程中调节细胞迁移的关键介质家族。趋化因子功能的实施主要是通过与不同类型细胞表面的七次跨膜G蛋白耦联受体 (GPCR) 结合，进而触发细胞的运动和激活细胞所必需的信号通路得以实现〔9〕。趋化因子GPCRs主要由白细胞表达，最初发现其主要功能是参与白细胞运输和归巢、整合素的激活、超氧阴离子的产生及颗粒内容物的释放，这些功能可构成宿主抵抗入侵微生物和组织损伤的第一道防线〔10〕。趋化因子家族成员的分子量为8～10 kD，根据靠近氨基端的前两个半胱氨酸的位置，趋化因子蛋白可被分为4个高度保守的家族，分别为CXC、CC、C和CX3C。人们已经发现了50多种趋化因子和至少有18种人类趋化因子GPCRs〔11〕。除了经典的趋化因子GPCRs外，人们最近又鉴定出一些非典型趋化因子受体，它们包括ACKR1～6〔12〕。趋化因子/GPCRs轴的一个显著特征是具有混杂的对应关系，一方面一些趋化因子可结合一个以上的GPCRs，而另一方面有些GPCRs也表现出不同亲和力的重叠配体特异性〔13〕。趋化因子/GPCRs轴的这种混杂性有利于宿主根据微环境的变化灵活地动员细胞内各种机制〔13〕。除了介导免疫细胞向炎症部位迁移外，趋化因子还被发现在淋巴组织的发育、免疫细胞的成熟及适应性免疫应答中具有关键作用〔14〕。此外，趋化因子及其相应受体表达失衡还与人类许多疾病如自身免疫性疾病、炎症性疾病及肿瘤等有关〔15〕。在肿瘤中，趋化因子具有直接或间接地影响肿瘤免疫、肿瘤生物表型、肿瘤进展、肿瘤治疗和患者预后等作用〔16〕。研究证实，在肿瘤微环境(TME)中，肿瘤相关宿主细胞和肿瘤细胞均可释放一系列不同种类的趋化因子，来引导不同类型免疫细胞的招募和激活，最终影响抗肿瘤和促肿瘤之间的平衡〔17〕。除了发挥趋化细胞的主要功能外，趋化因子还可通过直接靶向TME非免疫细胞(如肿瘤细胞和血管内皮细胞)，来影响肿瘤发展演进的多个进程，如肿瘤细胞的生长、转移和血管生成等〔16〕。研究证实，肿瘤细胞可刺激基质细胞合成和分泌促进生长的趋化因子，从而建立一种有利于肿瘤进程的肿瘤-间质相互作用〔18〕。此外，TME的辅助细胞，如肿瘤相关成纤维细胞(TAMs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAFs)，也被证明可以产生趋化因子并促进肿瘤进程〔19，20〕。本实验旨在研究趋化因子CXCL1影响人口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验所需细胞和试剂 KB人口腔鳞状细胞癌细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)、DMEM培养基(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美国NQBB公司)、Transwell小室(美国Corning公司)、胰蛋白酶(上海碧云天生物技术有限公司)，重组人趋化因子CXCL1蛋白(美国PeproTech公司)、放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解缓冲液和苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂(北京白鲨易科技有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程公司)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国MerckMillipore公司)、CCK-8细胞增殖检测试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)、增强化学发光(ECL)超敏显影液(上海研生生化试剂有限公司)、单克隆小鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体(美国Abcam公司)、多克隆兔抗人AKT抗体(美国Affinity Biosciences公司)。

1.2CCK-8细胞增殖检测 将处于对数生长期的KB人口腔上皮癌细胞株进行常规消化和计数；加入适量DMEM完全培养基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素)将细胞密度调至2.0×104个/ml；吹打混匀细胞后，向每96孔板中均匀铺入100 μl细胞悬液，使细胞数量为2×103个/孔；将培养孔中的细胞随机分为对照组和CXCL1处理组，每组设置10个复孔；对照组细胞培养基中不加CXCL1；CXCL1各处理组加入CXCL1以使各组培养基CXCL1终浓度为5、10、20和30 ng/ml；将细胞在37℃ CO2培养箱中培养72 h；分别向每孔中加入10 μl CCK8检测试剂，然后在37℃ CO2培养箱中孵育2 h；利用酶标仪读取各孔450 nm波长的吸光度值。

1.3Transwell细胞迁移检测 将处于对数生长期的KB人口腔鳞状细胞癌细胞株用无FBS的DMEM培养基调至密度为1.0×105个/ml；吹打混匀细胞后，将100 μl细胞悬液均匀加入Transwell上室中，使细胞数量为1×104个/室；将小室中的细胞随机分为对照组和CXCL1处理组，每组设置5个复孔；对照组下室的培养基为含10%FBS的DMEM完全培养基；CXCL1各处理组下室的培养基分别为CXCL1终浓度为5、10、20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培养基；将细胞在37℃ CO2培养箱中培养24 h；用脱脂棉签擦拭掉小室上表面未迁移的细胞；用甲醇-结晶紫液对附着在下表面的细胞进行固定和染色5 min；自来水冲洗5 min后在室温环境下干燥15 min；于倒置显微镜下拍照并计数，以观察细胞迁移情况。

1.4Western印迹实验 将处于对数生长期的KB人口腔上皮癌细胞株培养在6孔板中；对照组的培养基为含10%FBS的DMEM完全培养基；CXCL1各处理组的培养基分别为CXCL1终浓度为20和30 ng/ml的含10%FBS的DMEM完全培养基；将细胞在37℃ CO2培养箱中培养72 h；胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，室温离心10 min(1 000 r/min)；去除上清后，向细胞沉淀中加入150 μl 含1%PMSF的RIPA蛋白裂解缓冲液，剧烈吹打以使细胞充分裂解；在4℃环境下于高速离心20 min(15 000 r/min)；收集上清液，利用BCA蛋白定量试剂盒测定各组样本蛋白浓度；将30 μg总蛋白上样于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶孔道中并进行垂直电泳，然后将凝胶中蛋白转印到PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭后，转印膜分别用β-actin(1∶5 000)和AKT(1∶1 000)一抗在4℃环境下孵育过夜；磷酸缓冲液-吐温(PBS-T)缓冲液洗除一抗后，将转印膜分别用HRP-羊抗小鼠IgG(1∶10 000)和HRP-羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗在37℃环境下孵育30 min；PBS-T缓冲液彻底洗涤后，将ECL试剂滴加到转印膜上反应，然后利用凝胶成像系统拍照并测定条带灰度值。

1.5统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1趋化因子CXCL1促进KB细胞的增殖活性 各组细胞生长72 h后，经CCK-8实验检测所示，对照组、5、10、20和30 ng/ml CXCL1处理组的吸光度值分别为1.201±0.007、1.503±0.005、1.695±0.010、1.941±0.015和1.661±0.009。与对照组比较，5、10、20和30 ng/ml CXCL1处理组KB细胞的增殖能力显著增强(P=0.000)。该结果表明，趋化因子CXCL1对KB人口腔鳞状细胞癌细胞株的增殖活性有明显促进作用。

2.2趋化因子CXCL1促进KB细胞的迁移活性 各组细胞迁移24 h后，经Transwell实验检测所示，对照组、5、10、20和30 ng/ml CXCL1处理组的迁移细胞数分别为(101.2±53.101)个、(286.0±49.300)个、(327.0±38.962)个、(340.6±50.073)个和(293.6±28.112)个。与对照组比较，5、10、20和30 ng/ml CXCL1处理组KB细胞的迁移能力显著增强(P=0.001；P=0.000)。该结果表明，趋化因子CXCL1对KB人口腔鳞状细胞癌细胞株的迁移活性有明显促进作用。

2.3趋化因子CXCL1上调KB细胞AKT蛋白水平 对照组、20和30 ng/ml CXCL1处理组AKT蛋白表达水平分别是0.539±0.048、0.905±0.090和0.700±0.091。与对照组比较，20和30 ng/ml CXCL1处理组KB细胞的AKT蛋白表达水平显著上调(P=0.003；P=0.006)。

3 讨 论

炎症是TME的重要组成部分，也是肿瘤的重要标志之一。肿瘤相关炎症的主要特征包括白细胞(特别是TAFs)的浸润，炎症多肽信使如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1和趋化因子CXCL8等的存在及组织重塑和血管发生等〔21〕。研究发现，某些癌症中的炎症状况要先于恶性肿瘤的发展，而在另一些癌症中，致癌性变化则可对相应促肿瘤炎症环境发挥驱动作用〔22〕。然而，无论炎症如何起源，其都有助于促进恶性细胞的增殖、存活与转移，刺激血管生成及改变肿瘤细胞对激素和化疗的敏感性〔22〕。趋化因子是一类小分子分泌性细胞因子家族成员，其最初被发现是嗜中性粒细胞和单核细胞等白细胞的有效引诱剂，因此被认为是急、慢性炎症的重要介质。近年来，越来越多的证据表明，除了炎症外，趋化因子可在机体的发育、稳态的维持及多种病理生理过程如骨质疏松、肥胖和肿瘤中发挥重要调节作用〔23〕。在肿瘤研究中，人们首先发现趋化因子在决定肿瘤间质的组成方面具有关键作用，但后来证实其亦可直接影响肿瘤细胞的增殖、转移和血管形成〔24〕。肿瘤的生长和扩散是肿瘤细胞本身及其与TME组分之间动态相互作用的结果。在这方面，趋化因子即可参与肿瘤细胞向转移部位的归巢，又可参与不同类型细胞如TAMs、CAFs、肿瘤相关中性粒细胞(TANs)、淋巴细胞、间充质干细胞(MSCs)和内皮细胞向TME招募〔23〕。研究证实，肿瘤部位的炎性相关CC(如CCL2、CCL3、CCL5)和CXC(如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8)趋化因子可招募表达趋化因子CC配体受体2+(CCR2+)的单核细胞和趋化因子CXC配体受体2+(CXCR2+)的中性粒细胞进入TME，并促使后者分化为TAMs和TANs〔25〕。TME中肿瘤细胞、肿瘤相关细胞及白细胞均可分泌多种趋化因子，它们可与肿瘤细胞表达的趋化因子受体相结合，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外调节蛋白激酶(ERK)等信号通路来促进肿瘤细胞的增殖〔26,27〕。此外，趋化因子还可通过阻止肿瘤细胞的凋亡和调节促凋亡/抗凋亡分子之间的平衡，如下调B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达或抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和caspase-9激活来促进肿瘤细胞的存活〔28〕。CXCL1又名生长相关癌基因蛋白(GRO)-α，其可通过与其受体CXCR2的相互作用经多条信号途径参与肿瘤细胞的恶性进程〔29〕。本研究证实，CXCL1处理后KB细胞AKT蛋白水平也出现上调，这与我们在BEL-7402肝癌细胞的研究结果相一致〔30〕。