肌萎缩侧索硬化致病蛋白与自噬相关研究进展

刘玥 朱瑜 江建香 江师师 徐仁伵

(1江西省人民医院神经内科，江西 南昌 330006；2南昌大学医学部研究生院)

肌萎缩侧索硬化(ALS)是以上下运动神经元损伤为特点的神经系统变性病中的一种，其预后较差，一般平均生存期为3～5年。目前仅有利鲁唑及依达拉奉用于临床治疗〔1〕。现今流行的致病学说较多，诸如蛋白质的异常积聚及毒性作用，星形胶质细胞激活小胶质细胞引起的炎症反应损伤神经元，神经元内质网应激及运动神经元的轴突运输损害等〔2〕，其中较为主流的致病学说为蛋白质的异常积聚及毒性作用，由于众多异常蛋白的累积，细胞离不开自噬与泛素蛋白酶体降解途径。泛素蛋白酶体系统主要是对于短寿命蛋白质的降解，而自噬则优先用于选择性降解长寿命的蛋白质和损伤的细胞器。自噬是高度保守的分解代谢细胞通路，用于降解基础水平的蛋白质和细胞器及病理条件下的病原体和蛋白质聚集体〔3〕。本文对自噬过程及其与ALS相关致病蛋白的相互作用进行综述。

1 自噬概述

自噬的定义为在所有真核生物中保守的分解代谢过程。从调节细胞内的基本代谢功能到各种疾病，如衰老、癌症、神经退行性疾病和溶酶体病等，自噬已经成为控制人体内稳态的中心调节点〔4〕。自噬的神经保护作用源于其消除诸如α-突触核蛋白或tau蛋白等致病蛋白的能力。然而，不同的致病蛋白可能影响自噬过程的不同类型和步骤。自噬功能紊乱已在多种疾病中被报道，包括神经退行性疾病，如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)及ALS等〔5～8〕。自噬是一种有效的神经保护机制，可积极促进致病蛋白清除，但在某些情况下，其会成为这些蛋白质毒性作用的靶点。当致病蛋白直接干扰自噬细胞内维持细胞功能的组成成分时，或当自噬过程受到间接干扰时，这种对自噬系统的毒性可能是导致疾病的主要原因。因此，了解自噬的分子机制及过程对疾病发生发展及治疗都有一定作用。根据到溶酶体的物质，自噬途径在哺乳动物中有3种类型的自噬。在巨自噬中，细胞胞质内底物首先被困在双膜囊泡(自噬体)中，然后与溶酶体融合，使底物完全降解。参与这一过程的基因和蛋白质被称为自噬相关基因和自噬相关蛋白〔9,10〕，在伴侣介导的自噬中，蛋白质被胞质中协同作用的伴侣蛋白识别，该伴侣蛋白将底物带到溶酶体表面，使其在溶酶体表面进行转运。最后，在微自噬和内质体微自噬中，底物通过溶酶体和内质体膜内陷而内化〔11〕。因此，了解自噬过程及相关蛋白与自噬的关系，有助于通过干预或诱导自噬等手段，缓解疾病发生发展过程，以达到一定的治疗目的。

2 ALS中致病蛋白与自噬

ALS中存在多种蛋白异常积聚，如 Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)1、Tar DNA结合蛋白(TDP)-43、肉瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白(FUS/TLS)、9号染色体开放阅读框72编码蛋白(C9orf72)、囊泡相关蛋白(VAP)B等〔12,13〕。这些相关蛋白的基因突变或蛋白积聚在ALS的发病过程中均参与一定作用。

2.1Cu/Zn SOD1 SOD1基因突变是经典的ALS致病模型。被损害抗氧化功能的SOD1突变可导致超氧化物的毒性积累〔14〕。目前Perera等〔15〕发现在ALS相关的SOD1或TDP-43突变体的运动神经细胞中进行强烈自噬诱导，如对SOD1G93A小鼠施用Rilmenidine(一种抗高血压剂，与咪唑啉-1受体激动剂可诱导自噬)可上调脊髓中的自噬和线粒体自噬，从而导致可溶性mtSOD1水平降低。同时，Rudnick等〔16〕研究发现在表达突变型SOD1的ALS小鼠模型中，发现运动神经元在疾病进展早期形成含有泛素聚集体的大自噬体。研究者为了研究这种反应是保护性的还是有害的，在小鼠体内通过敲除Atg7(关键的自噬基因)，即Atg7cKO小鼠，发现敲除后的小鼠表现出神经肌肉连接的结构与功能缺陷。通过将Atg7cKO小鼠与mtSOD1小鼠模型杂交，发现自噬抑制加速了胫前肌早期神经肌肉失神经和后肢震颤的发生。然而，也发现Atg7cKO SOD1G93A双突变小鼠的寿命延长了。自噬抑制并不能阻止运动神经元细胞的死亡，但它能减轻脊髓神经间质的胶质炎症，阻断应激相关转录因子c-Jun的激活。因此运动神经元自噬在疾病早期维持神经肌肉的神经支配，但最终以非细胞自主的方式促进疾病的进展〔16〕。

2.2TDP-43 TDP-43是一种核RNA结合蛋白，参与RNA加工的几个方面，主动在细胞核和细胞质之间穿梭工作〔17,18〕。在ALS与额颞叶痴呆(FTD)中，TDP-43被排除在细胞核之外，但这种细胞质错误定位在神经元损伤或应激中很常见〔19,20〕，TDP-43阳性包涵体可能是诸如AD等神经退行性病变的继发病理特征〔21〕。Barmada等〔22〕开发并验证了一种单细胞光学方法，发现致病突变可缩短TDP-43的半衰期。刺激自噬可改善TDP-43清除和定位，并可提高携带TDP-43突变的小鼠原代神经元、人类干细胞衍生神经元和星形胶质细胞的存活率。其次，该团队发现TDP-43的水平和定位能决定神经毒性，并表明自噬诱导通过直接作用于TDP-43清除来减轻神经变性〔22〕。Wang等〔23〕研究发现雷帕霉素(一种依赖mTOR的自噬激活剂)在TDP-43阳性泛素化包涵体(UBIs)为特征的FTLD-U小鼠模型的早期病理阶段给药，可挽救学习记忆障碍、脑缺血再灌注损伤及小鼠的运动功能异常，同样伴随着caspase-3水平降低和小鼠前额神经元丢失减少。此外，病理后期的自噬激活也能改善运动功能，并伴有TDP-43阳性UBIs的降低。该研究为自噬激活剂治疗神经退行性疾病奠定了基础。

2.3FUS/TLS 有5%～10%ALS病例是家族性的，而SOD1、TDP-43、FUS突变占家族性ALS的30%左右〔24〕。FUS是一种广泛表达的526氨基酸组成蛋白，由15个外显子编码，属于多功能DNA/RNA结合蛋白的FET/TET家族，最初被发现作为人类癌症融合癌基因的组成部分〔25,26〕。ALS与核RNA结合蛋白(RBP)的聚集相关，包括FUS。如何在健康的运动神经元中预防FUS聚集和神经变性仍是无法回答的问题。有研究通过使用ALS患者尸检组织和诱导多功能干细胞衍生神经元的组合来研究FUS突变对RBP稳态的影响，结果显示FUS的聚集倾向通常通过相互作用的RBP缓解，但当FUS由于ALS突变而错误定位于细胞质时，这种缓冲会消失〔27〕。细胞质中存在易聚集的FUS导致RBP稳态失衡，加剧神经变性。然而，使用小分子增强自噬减少细胞质FUS，可恢复RBP稳态并在体内挽救神经细胞运动功能。因此RBP稳态的破坏在FUS-ALS中起关键作用，并可通过刺激自噬来治疗。

2.4C9orf72 C9orf72中的GGGGCC(G4C2)重复扩增是ALS和FTD常见的遗传原因〔28,29〕。C9orf72 的核苷酸重复扩增(NRE)导致这些疾病的致病机制包括C9orf72功能的丧失和由NRE编码的毒性RNA和蛋白质驱动的C9orf72功能机制的获得。这些机制与在患者和动物模型中观察到的几种细胞缺陷(包括核质运输缺陷和核应激)有关〔30〕。Liu等〔31〕研究发现C9orf72是溶酶体靶向和降解CARM1所必需的，而精氨酸甲基转移酶(CARM)1是巨自噬/自噬和脂质代谢的重要表观遗传调节因子。在C9orf72缺乏的细胞中，包括来自ALS-FTD患者的细胞，CARM1异常积累，特别是在糖剥夺应激下，可导致自噬和脂质代谢失调。这些结果表明，C9orf72是营养应激反应中负反馈调控自噬溶酶体途径的关键调节因子。有研究表明在C9orf72突变的 ALS/ FTD患者中，发现了p62在小脑、海马和新皮质中积聚，表明自噬受损〔32,33〕。p62与C9orf72相互作用，在C9orf72突变的患者衍生的成纤维细胞中检测到p62水平升高。此外，在神经元中C9orf72敲低后，自噬受损并且p62和TDP-43在聚集体中累积〔34,35〕。

2.5VAPB VAP蛋白是具有氨基末端主要精子蛋白(MSP)结构域和跨膜结构域的同源蛋白。其中VAPB是一种多功能蛋白，参与内质网至高尔基体之间的蛋白转运、神经肌肉接头发育及神经元轴突延伸。其中，VAPB突变可致家族性ALS。Lin等〔36〕、Wu等〔37〕研究表明VAPB的敲除诱导自噬蛋白Beclin1表达上调，促进微管相关蛋白1轻链(LC)3转化和LC3斑片形成，而VAPB的过表达抑制了这些过程。VAPB对Beclin1的调控处于转录水平。此外，敲除VAPB可增加自噬通量，并促进自噬底物p62和神经退行性疾病蛋白的降解。Sentürk等〔38〕发现自噬-溶酶体降解需要有如VAPB等引起ALS的蛋白，VAP蛋白的丧失会导致酸度异常的溶酶体积累。其中VAP33突变体显示出自噬小泡，尤其是自噬溶酶体的大量积累。由于VAP蛋白位于内质网膜、内质网-高尔基体系膜，并直接与脂质转移蛋白相互作用。这种束缚促进高尔基体向内质网的4-磷脂酰肌醇4-磷酸(PtdIns4P)的转移，因此，VAP的丢失导致高尔基体中PtdIns4P的积累，从而强烈促进自噬体的产生，这些自噬体没有被适当地酸化而成为功能性溶酶体，从而损害了自身溶酶体的降解能力。

3 总 结

运动神经元是哺乳动物最极化的细胞，其细胞活性高度依赖于有效的能量供应、轴突小泡长距离逆行运输及受损细胞器和异常蛋白聚集体的适当清除等的协作。而在导致ALS及其相关疾病如FTD中的近40个遗传因素中，包含了几个基因编码与自噬有关的蛋白质，包括TBK1、泛素结合蛋白(SQSTM)1/p62、视神经蛋白(OPTN)、泛醌蛋白(UBQLN)2、VCP和C9orf72的突变〔39〕。自噬过程无疑是中枢系统调节分解代谢及循环过程的重要机制之一。大量研究已经证明了异常蛋白积聚于神经元细胞的过程，因此，对于自噬的研究也成为治疗ALS等相关疾病重要靶点。

目前，针对ALS的自噬研究机制表明，在实验性ALS背景下，由于干预措施及所采用的动物模型不同，自噬水平的药理学和遗传学调节可能导致与小鼠存活和疾病进展不同甚至相反的后果。如利用雷帕霉素或触发mTOR独立自噬的药物(即亚精胺和卡马西平)治疗TDP-43突变小鼠可防止疾病发展〔23,39〕。而在有些研究中表明对突变的SOD1转基因小鼠施用雷帕霉素会因细胞凋亡增强而加剧疾病进展，或可能根本没有影响〔40,41〕。通过给予海藻糖(该途径的mTOR非依赖性诱导物)激活自噬可防止SOD1转基因小鼠发病〔42～44〕。在运动神经元特异性Atg7条件敲除小鼠(Atg7cKO)中，Atg7的丢失不足以引起这些小鼠的神经变性。然而，运动神经元的靶向自噬导致影响选择性肌肉连接的自发表型。Atg7cKO小鼠出现了与胫骨前肌早期ALS退化的运动神经元支配的神经肌肉连接形态紊乱相关的电生理改变，这些结果揭示了自噬和蛋白质稳定连接在运动神经元肌肉维持中的生理作用〔16,39〕。同时，已有研究报道了通过使用Atg7单倍体不足小鼠对重要自噬调节因子Becn1/Beclin1基因进行基因消融，尽管会增加蛋白质积聚，但仍能延长ALS小鼠的寿命〔45〕。而另一项研究发现相反的结果，与对照组相比，SOD1G127X和SOD1G93A小鼠的Becn1杂合子，发展出更具攻击性的表型〔46〕。尽管出现了神经肌肉连接受损，但上述的两种实验小鼠均发现比相应单倍体不足小鼠寿命有所延长。在分子水平上发现，Atg7cKO SOD1 G93A小鼠显示出预期的电生理和肌肉连接改变〔16〕，证实自噬是维持神经肌肉连接完整性的关键过程。该研究证明，早期自噬是维持脆弱运动神经元肌肉连接的生理机制。相反，在晚期，运动神经元自噬作为一种有害的机制发挥作用，可能通过细胞非自主机制加速ALS的进展。表明在一定程度上与所用动物模型的差异、受试药物的非特异性、治疗开始的疾病进展阶段及该途径在神经元和神经胶质细胞中可能的不同作用有关。提示自噬活性可能影响ALS的进展及靶向通路的特异性效应应该以一种时间和细胞特异性的方式进行更详细的研究，并尽可能与多种疾病参数进行比较。

综上，包括SOD1、TDP-43、FUS、C9orf72及VAPB等在内的相关基因及蛋白均在一定程度上与自噬产生相互促进或抑制作用，而ALS中自噬激活与抑制会因疾病不同阶段甚至所属实验动物的不同而产生不同作用。因此，在某些特定条件下研究促进或抑制自噬或许会减缓疾病进展，对ALS患者是一个较有效的保守治疗方案。但目前自噬在ALS中的相关机制尚未完全明了，应深入研究。