HPLC法同时测定不同产地菝葜中5种成分的含量

时向利，朱 倩

（1.江苏康缘医药商业有限公司质量部，江苏连云港 222000；2.江苏康缘药业股份有限公司质量部，江苏连云港 222000）

菝葜为百合科植物菝葜Smilax chinaL.的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀之功效，用于小便淋浊、带下量多、风湿痹痛、疔疮痈肿[1]，临床上用于慢性盆腔炎、附件炎等疾病的治疗[2-3]。菝葜中主要含有黄酮类、有机酸类和皂苷类化学成分[4-5]，具有抗炎、抗肿瘤的作用[5-7]。2020年版《中国药典》菝葜质量标准中未收载含量测定项，难以全面控制菝葜的质量，菝葜含量测定方面的文献报道主要有白藜芦醇和黄酮类成分的含量测定[8-9]，本文以菝葜中活性成分绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷为对象，建立同时测定菝葜中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷5种成分含量的方法，研究不同产地菝葜中5种成分的含量，可用于控制菝葜的质量。

1 仪器和试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器；梅特勒MS105DU型电子分析天平；德意生040S型超声波清洗机。

绿原酸（批号110753-202018，含量以96.1%计）、落新妇苷（批号111798-201805，含量以93.6%计）、黄杞苷（批号111906-201102，含量以93.7%计）和白藜芦醇（批号111535-201703，含量以99.4%计），中国食品药品检定研究院；异黄杞苷（批号20210615，纯度≥98%），购自北京谨明生物科技有限公司。乙腈和磷酸为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甲醇为分析纯。

22批菝葜药材产地信息如下：S1，S2：安徽亳州；S3：安徽潜山；S4：安徽霍山；S5：安徽宣城；S6，S7：湖南岳阳；S8：湖南株洲；S9：湖南韶山；S10：湖南邵阳；S11：云南大理；S12：云南普洱；S13：云南昆明；S14：贵州遵义；S15：贵州兴义；S16：贵州遵义；S17：四川绵阳；S18：四川德阳；S19：湖北宜昌；S20：湖北蕲春；S21：江西赣州；S22：江西南昌。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6×150mm，3.5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液；梯度洗脱，0～8min：6%→10%乙腈；8～35min：10%→35%乙腈；柱温35 ℃；流速1.0mL/min；检测波长303nm；进样量为10μL。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 溶液配制

混合对照品溶液：取绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷对照品，精密称定，用甲醇溶解制备为混合对照品溶液，浓度分别为100μg/mL、500μg/mL、100μg/mL、60μg/mL 和25μg/mL。

供试品溶液：取菝葜药材粉末约1.5g，精密称定，移至带塞的三角瓶中，精密量取甲醇50mL加入三角瓶中，称重，超声提取50min，放冷后再称重，用甲醇补重，摇匀，放置，取适量上清液离心，即得。

2.3 精密度试验

取混合对照品溶液进行进样分析，连续进样6针。色谱图中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷的峰面积RSD分别为0.65%、0.71%、0.92%、0.69%和1.03%。

2.4 线性关系的考察

精密称取落新妇苷11.75mg，转移至100mL容量瓶内，加甲醇使溶解后稀释至刻度，作为落新妇苷母液。分别精密称取绿原酸、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷对照品13.00mg、11.69mg、12.49mg和6.61mg，转移至同一50mL容量瓶内，加落新妇苷母液制成X1溶液，将X1溶液用甲醇逐倍稀释得X2、X3、X4、X5、X6和X7溶液，分别进样测定。用各指标成分的峰面积对浓度（μg/mL）进行线性回归，结果如下：绿原酸回归方程Y=24.5598X+10.7828，r=0.9999，范围3.90～249.86μg/mL；落新妇苷：回归方程Y=9.1233X- 1.4909，r=1.0000，范围17.19～1100.20μg/mL；黄 杞 苷：回 归 方 程Y=15.7221X+0.4547，r=1.0000， 范 围 3.42～219.00μg/mL ； 白藜芦醇：回归方程Y=16.0187X-1.1474，r=0.9997，范 围3.88～248.40μg/mL；异 黄 杞 苷：回 归 方 程Y=8.3343X+1.0147，r=0.9999， 范 围 2.07～132.24μg/mL。

2.5 稳定性试验

取编号为S1的菝葜药材粉末，制备一份供试品溶液，室温条件下放置0h、4h、8h、12h和16h时，进样分析。计算5个时间点所得图谱中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷峰面积的RSD，结果分别为1.58%、1.22%、1.37%、1.94%和1.16%。

2.6 重复性试验

取编号为S1的菝葜药材粉末6份，制备供试品溶液，进样分析，计算每份样品中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷的含量和6份样品的平均含量。6份供试品中，5个指标成分的平均含量分别 为 4.72mg/g、16.39mg/g、5.24mg/g、2.81mg/g和1.06mg/g，RSD分别为1.56%、1.19%、1.74%、1.82%和2.09%。

2.7 回收率试验

取编号为S1的菝葜药材粉末6份，每份取约0.75g，精密称定，分别加入混合对照品母液2.0mL，制备供试品溶液，进样分析。结果见表1。

表1 加样回收率结果（n=6）

2.8 样品测定

取表1中22批菝葜药材粉末进行测定，结果见表2。

表2 22批菝葜中5个指标成分的含量（单位：mg/g，n=2）

续表

从表2可知，5种指标成分的含量分别为0.52～6.89mg/g、0.63～34.18mg/g、0.27～7.16mg/g、0.84～4.32mg/g 和0.087～1.78mg/g。从5种成分的均一程度来分析，均一性最好的为安徽产地的5批菝葜药材，其他产地的药材差异较大。

3 结论

采用全波长扫描方式，采集绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷在190～400nm的吸收光谱，根据5种成分的紫外吸收曲线选择303nm作为含量测定的检测波长。在进行色谱柱优选时，粒径为5μm的色谱柱所得色谱图中需测定的指标成分分离效果差，达不到定量分析的要求，粒径为3.5μm的色谱柱所得色谱图中5个指标成分的分离度均能达到定量要求。

本文建立了HPLC方法同时测定不同产地菝葜中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷的含量，并进行了完整的方法学验证。从测定的22批菝葜药材中绿原酸、落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇和异黄杞苷的含量结果可知，白藜芦醇含量差异最小，含量最高与最低差异约为5倍，落新妇苷含量差异最大，含量差异高达五十多倍，可能与生长环境、土壤和采收季节等多种因素有关。菝葜药材存在良莠不齐的现象，应引起重视。