补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠胎盘滋养细胞miR-187、VEGF、VEGF-R2表达的影响

梁雪宝，王肖莉，张意林，刘敏，侯阿美，储继军

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28周前与同一性伴侣连续发生3次及以上的自然流产。有研究显示，连续发生2次流产者再次流产概率明显升高，应予重视[1]。调查显示，全球约1%～5%的育龄期女性患有RSA，给人类生殖健康造成重大威胁[2]。遗传、解剖、血栓形成、免疫反应等为RSA的常见因素，但仍有50%～60%患者病因不明[3

]。

研究表明，母胎界面血管生成障碍与RSA发生关系密切，血管内皮生长因子（VEGF）在其中扮演重要角色[4]。微小RNAs（miRNAs）为一类内源性单链非编码RNA，可通过调控VEGF表达影响母胎界面血管生成，从而参与RSA形成[5-6]。补肾安胎冲剂为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，前期研究表明，补肾安胎冲剂可升高RSA小鼠蜕膜组织VEGF及其受体表达，促进血管生成[7-9]。前期对miRNAs进行筛查发现，miR-187可靶向调控VEGF基因。本研究在前期研究基础上，通过体外实验观察补肾安胎冲剂含药血清对RSA小鼠胎盘滋养细胞miR-187/VEGF通路的影响，探讨补肾安胎冲剂治疗RSA的分子机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性CBA/J小鼠18只，6～7周龄，体质量（19±2）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008。雄性DBA/2、BALB/c小鼠各5只，6～7周龄，体质量（19±2）g；SPF级雄性SD大鼠20只，6～7周龄，体质量（200±10）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。实验动物均于安徽省中医院动物实验中心进行标准饲养。

1.2 药物

补肾安胎冲剂（菟丝子10 g，桑寄生10 g，续断10 g，熟地黄10 g，炙黄芪20 g，麸炒白术10 g，党参10 g，黄芩10 g，白芍10 g，苎麻根10 g，墨旱莲15 g），由安徽中医学院第一附属医院制剂室提供，批号BZ20080017。

1.3 主要试剂与仪器

Trizol（货号15596018），美国Life Technogy；PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（货号RR047A），日 本TaKaRa；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（货号E096-01B），苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；DEPC水（货号D1007），上海捷瑞生物；VEGF抗体（货号bs-1313R），北京博奥森；血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）抗体（货号ab39256），英国Abcam；GAPDH抗体、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（货号分别为TA-08、ZB-2305、ZB-2301），北京中杉金桥；ECL超敏发光试剂盒（货号340958），美国Thermo；Lipofectamine 2000（货号11668-019），美国Invitrogen；双荧光素酶试剂盒（货号E1910），北京普洛麦格；VEGF-WT（野生型）、VEGF-MU（突变型）质粒，上海汉恒生物科技有限公司合成；miR-187模拟物及无义miR-187、miR-187 inhibitor及空白miR-187 inhibitor，上海吉玛制药技术有限公司设计合成。荧光定量PCR仪（型号PIKOREAL 96），美国Thermo Scientific公司；EPS300电泳仪（型号EPS300）、VE-180电泳槽（型号VE-180），上海天能科技有限公司；流式细胞仪（型号CytoFLEX），贝克曼库尔特有限公司。

2 实验方法

2.1 造模

参照Clark等[10]方法，将18只雌性CBA/J小鼠分别与5只DBA/2雄鼠和5只BALB/c雄鼠合笼饲养，建立RSA小鼠模型和正常妊娠小鼠，每组9只。次日清晨检查雌鼠阴道，见阴栓者，计为妊娠第0天，无则继续合笼饲养。妊娠15 d后，腹腔注射10%异戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉孕鼠，颈椎脱臼处死，取出完整子宫，分离胎盘组织，置于-80℃冰箱保存。

2.2 细胞分离、培养及转染

取胎盘组织剪碎，用胰蛋白酶和DNaseⅠ消化，PBS重悬，采用Percoll密度梯度分离液分离，收集滋养细胞层，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。按Lipofectamine 2000说明书，将miR-187 inhibitor或空白miR-187 inhibitor转染至胎盘滋养细胞。

2.3 含药血清制备

将20只大鼠随机分为含药血清组与空白血清组，每组10只。含药血清组以补肾安胎冲剂11.7 g/（kg·d）灌胃（按体表面积计算，相当于成人等效剂量的3倍），空白血清组予蒸馏水灌胃，灌胃体积0.2 mL/10 g，2次/d，连续7 d。末次给药2 h后，腹主动脉取血，3 000 r/min离心20 min，取上层血清，灭活，除菌，-80℃冰箱保存。

2.4 含药血清浓度和作用时间筛选

将RSA模型小鼠胎盘滋养细胞以1.0×105个/mL接种至96孔培养板中，每孔100μL，置于培养箱中培养24 h。将细胞分为对照组及1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含药血清组，每组3个复孔。对照组加入20%空白血清，其余各组分别加入相应浓度补肾安胎冲剂含药血清，置于培养箱继续培养12、24、48、72 h，每孔加入10μL CCK8孵育4 h。设置空白组调零，于酶标仪波长450 nm处测量各孔吸光度（OD值），计算细胞活力。细胞活力=（实验组OD值-空白组OD值）÷（对照组OD值-空白组OD值）。

2.5 细胞分组及给药

将细胞分为正常对照组（正常妊娠小鼠胎盘滋养细胞+20%空白血清）、模型组（RSA小鼠胎盘滋养细胞+20%空白血清）、补肾安胎冲剂组（RSA小鼠胎盘滋养细胞+20%含药血清）、miR-187 inhibitor NC组（RSA小鼠胎盘滋养细胞转染空白miR-187 inhibitor+20%空白血清）、miR-187 inhibitor组（RSA小鼠胎盘滋养细胞转染miR-187 inhibitor+20%空白血清）、联合组（RSA小鼠胎盘滋养细胞转染miR-187 inhibitor+20%含药血清），每组9个复孔。将细胞接种至96孔板，按“2.2”项下方法转染后，加入相应血清，置于培养箱培养48 h。

2.6 RT-qPCR检测

收集各组细胞，采用Trizol法提取总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR。反应条件：95℃预变性1 min；95℃、20 s，60℃、1 min，共40个循环。miR-187以U6为内参，VEGF、VEGF-R2以β-actin为 内 参，2-ΔΔCt法 计 算mRNA表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot检测

收集各组细胞，每105个细胞加入RIPA裂解液600μL，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min。收集上清液，加入5×上样缓冲液，沸水浴加热10 min，冷却至室温，上样，凝胶电泳，恒流转膜至PVDF膜，Western洗涤液中漂洗5 min，加5%脱脂奶粉室温封闭2 h。滴加VEGF和VEGF-R2一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，加入二抗（1∶20 000），室温孵育2 h，PBST洗涤，ECL法显影。Image J软件对条带进行分析。

2.8 双荧光素酶实验

取对数生长期胎盘滋养细胞，以105个/孔接种至12孔板，将VEGF-WT（野生型）及VEGF-MU（突变型）质粒与miR-187模拟物或无义miR-187共转染至胎盘滋养细胞，转染后培养48 h，参照Promega双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

2.9 相关性分析

根据各组胎盘滋养细胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA相对表达量，采用SPSS26.0软件进行Spearman相关性分析。P＜0.05说明两变量具有相关性，r＞0为正相关，r＜0为负相关。

2.1 0统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。结果符合正态分布用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较，方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 补肾安胎冲剂含药血清浓度和作用时间筛选结果

随着含药血清浓度增加，细胞活力升高，当含药血清浓度为20%、作用48 h时，细胞活力最高。故选用20%含药血清、培养48 h进行后续实验。见图1。

图1 补肾安胎冲剂含药血清浓度和作用时间筛选

3.2 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞miR-187、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2 mRNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组细胞miR-187表达显著升高（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾安胎冲剂组细胞miR-187表达显著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与miR-187 inhibitor NC组比较，miR-187 inhibitor组细胞miR-187表达显著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与补肾安胎冲剂组及miR-187 inhibitor组比较，联合组细胞miR-187表达显著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表达显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组胎盘滋养细胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA表达比较（±s）

表2 各组胎盘滋养细胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与miR-187 inhibitor NC组比较，△P＜0.05；与补肾安胎冲剂组比较，▽P＜0.05；与miR-187 inhibitor组比较，□P＜0.05

组别正常对照组模型组补肾安胎冲剂组miR-187 inhibitor NC组miR-187 inhibitor组联合组n 9 9 9 9 9 9 miR-187 1.00±0.06 1.31±0.09*1.11±0.02#1.31±0.12 0.91±0.06△0.73±0.05▽□VEGF 1.00±0.07 0.44±0.06*0.59±0.02#0.45±0.03 0.51±0.02△0.67±0.06▽□VEGF-R2 1.00±0.07 0.45±0.05*0.60±0.01#0.44±0.03 0.52±0.00△0.70±0.03▽□

3.3 补肾安胎冲剂对胎盘滋养细胞血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾安胎冲剂组细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与miR-187 inhibitor NC组比较，miR-187 inhibitor组细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与补肾安胎冲剂组及miR-187 inhibitor组比较，联合组细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达显著升高（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R2蛋白免疫印迹

表3 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达比较（±s）

表3 各组胎盘滋养细胞VEGF、VEGF-R2蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与miR-187 inhibitor NC组比较，△P＜0.05；与补肾安胎冲剂组比较，▽P＜0.05；与miR-187 inhibitor组比较，□P＜0.05

组别正常对照组模型组补肾安胎冲剂组miR-187 inhibitor NC组miR-187 inhibitor组联合组n9 9 9 9 9 9 VEGF 0.67±0.05 0.19±0.04*0.43±0.06#0.19±0.04 0.29±0.07△0.53±0.08▽□VEGF-R2 0.77±0.04 0.27±0.02*0.54±0.01#0.28±0.02 0.40±0.02△0.61±0.02▽□

3.4 miR-187与血管内皮生长因子靶向关系

双荧光素酶实验结果表明，miR-187能够与VEGF靶向结合。与无义miRNA组比较，miR-187模拟物能够使VEGF-WT荧光素酶表达显著下调（P＜0.001）；而突变后，与无义miRNA组比较，miR-187模拟物对VEGF-MU荧光素酶表达无明显影响（P＞0.05）。见图3。

图3 miR-187与VEGF结合活性比较（±s，n=9）

3.5 相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，miR-187表达与VEGF、VEGF-R2 mRNA表达呈负相关（P＜0.01），r分别为-0.67、-0.69。见图4。

图4 miR-187与VEGF、VEGF-R2相关性分析

4 讨论

母胎界面血管重构在RSA发生发展中占重要地位。受精后第3周，绒毛血管开始生成，胎盘循环建立，循环灌注充足是维持胚胎正常发育的重要因素，若胎盘形成过程中血管增生失衡、血供不足，则可导致胚胎停止发育而流产[11]。促进母胎界面血管重构的关键在于血管新生，而血管新生是由促血管生成和抑血管生成因子调控的复杂过程，在这个过程中，VEGF作为最主要的促血管生成因子发挥重要作用[4]。其通过与跨膜受体VEGF-R1、VEGF-R2等结合，增加血管通透性、促血管内皮细胞迁移、增殖等[12]。Vidyadhari等[13]研究发现，VEGF基因多态性与南印度人RSA发生风险增加存在密切联系。Bagheri等[14]研究表明，与健康非妊娠者及健康妊娠者相比，RSA患者体内VEGF-A和VEGF-C表达明显降低，且与年龄、体质量指数及流产次数呈负相关，并指出VEGF-A、VEGF-C低表达与RSA易感性之间密切关联，可将其作为原因不明RSA患者流产发生的预测标志物。

miRNAs主要通过调控靶基因表达发挥作用，其主要通过介导血管生成、细胞增殖、凋亡、免疫耐受等参与RSA发生[15-16]。miR-187作为颇受关注的miRNA，在恶性肿瘤、脑缺血、骨质疏松等疾病中已有较深入的研究[17-19]。研究发现，与正常妊娠者相比，RSA患者绒毛组织miR-187表达显著升高[20]。Chen等[21]研究发现，与正常流产患者相比，RSA患者绒毛组织miR-187表达明显升高，进一步研究miR-187对RSA的影响发现，过表达的miR-187可通过下调BCL6表达抑制PI3K/AKT信号通路，从而起到抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭作用，最终导致RSA。

补肾安胎冲剂以肾主生殖、胞胎系于肾为理论依据，由寿胎丸化裁而来，具有补肾健脾、益气安胎之效。方中菟丝子益肾填精，为君药；桑寄生、续断补肝肾、安胎，熟地黄养血滋阴、益肾填精，党参、炙黄芪健脾益气固精，麸炒白术补益脾气、安胎，黄芩清热止血安胎，以上共为臣药；白芍养血敛阴止痛，苎麻根、墨旱莲凉血止血、安胎，共为佐使药。全方既补先天，又培后天，精充血旺，胎得所养，孕胎乃固。补肾中药被广泛用于治疗原因不明RSA[22]，且临床疗效显著。李伟莉等[23]用补肾安胎冲剂治疗RSA患者，分别于治疗前后检测患者血清VEGF及可溶性受体-1（sFlt-1）表达，发现补肾安胎冲剂可使VEGF表达升高，sFlt-1表达下降，从而促进胎盘血管新生，提高妊娠成功率。亦有实验表明，补肾安胎冲剂可提高RSA小鼠蜕膜组织VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表达，调节Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡，从而改善蜕膜血管重构，降低胚胎丢失率[7，24]。

本研究显示，RSA小鼠胎盘滋养细胞miR-187表达显著升高，VEGF、VEGF-R2 mRNA及蛋白表达显著降低。补肾安胎冲剂干预后，miR-187表达显著下调，VEGF、VEGF-R2 mRNA及蛋白表达显著上调，提示补肾安胎冲剂可能通过靶向调控miR-187/VEGF通路，介导血管新生，促进母胎界面血管重构，从而对RSA发挥治疗作用。本研究为补肾安胎冲剂治疗RSA的有效性提供实验证据，但RSA母胎界面血管重构机制较复杂，仍需联合临床试验进行更深入的探索。