海南虎刺枝叶中化学成分及其抗类风湿性关节炎活性研究

蓝 创，谢 珍，石倪霏，符永泉，熊舒荭，刘艳萍, 2, 3，付艳辉, 2, 3

海南虎刺枝叶中化学成分及其抗类风湿性关节炎活性研究

蓝 创1，谢 珍1，石倪霏1，符永泉1，熊舒荭1，刘艳萍1, 2, 3*，付艳辉1, 2, 3*

1. 海南师范大学 热带药用资源化学教育部重点实验室，海南 海口 571126 2. 海南师范大学 南药资源产业化关键技术研究海南省工程研究中心, 海南 海口 571126 3. 海南师范大学 南药资源产业化关键技术研究海口市重点实验室，海南 海口 571126

研究茜草科虎刺属植物海南虎刺枝叶中的化学成分及其抗类风湿性关节炎活性。综合运用硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备型HPLC等色谱技术进行系统分离和纯化，根据分离得到化合物的理化性质及其波谱数据，并通过与文献中报道的波谱数据进行比对，鉴定化合物的结构；采用MTS法通过对分离得到化合物的体外抑制滑膜细胞增殖的活性进行测试以评价其抗类风湿性关节炎活性。从海南虎刺枝叶的甲醇提取物中分离得到了18个化合物，分别鉴定为naucleidinal（1）、1,2,3,4-tetrahydronorharman-1-one（2）、19--methyl-3,14-dihydroangustoline（3）、latifoliamide B（4）、latifoliamide D（5）、bacilsubteramide A（6）、vinmajine I（7）、naucleofficine D（8）、1-甲氧甲酰-β-咔巴啉（9）、naphthisoxazol A（10）、1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（11）、rubiadin-1-methyl ether（12）、1,3,6-trihydroxy-2-methoxymethyl-9,10-anthraquinone（13）、3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl- 9,10-anthra quinone（14）、7-羟基色原酮（15）、5,7-二羟基色原酮（16）、6,4ʹ-dihydroxy-3ʹ-methoxyaurone（17）和farnisin（18）。抗类风湿性关节炎活性评价结果表明，化合物11～14、17和18对滑膜成纤维MH7A细胞增殖抑制活性的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L。所有化合物均为首次从虎刺属植物中分离得到。化合物11～14、17和18表现出了较为显著的抗类风湿性关节炎活性。

海南虎刺；naucleidinal；rubiadin-1-methyl ether；farnisin；抗类风湿性关节炎活性

茜草科（Rubiaceae）虎刺属C. F. Gaertn.植物全世界有13种和2变种，集中分布于亚洲东部。分布我国的虎刺属植物有11种，分布于西南部至东南部[1]。现代药理学研究表明虎刺属植物的提取物具有多样的生物活性如抗炎、抗肿瘤、抗疟以及神经保护等[2-6]。由于虎刺属植物分布的地域独特性和特有性，关于虎刺属植物中的化学成分及其生物活性的研究报道极为罕见。截至目前，国内外学者一共从该属植物中仅分离鉴定了18个化合物，主要为蒽醌类化合物[7-9]。在海南分布的虎刺属植物仅有1种，即为海南虎刺(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan。海南虎刺为海南特有植物，为黎族民间药用植物，具有祛风利湿、活血止痛的功效，常用于感染和炎症性疾病的治疗，药用历史悠久，疗效显著[1]。截至目前，未见任何关于海南虎刺中化学成分及其药理活性的研究报道，为了阐明海南虎刺的抗炎药效物质基础，同时为了更合理地开发利用该植物资源，充分发挥其药用价值，本研究对海南虎刺枝叶的甲醇提取物中的化学成分进行了系统研究，从中分离得到了18个化合物，分别鉴定为naucleidinal（1）、1,2,3,4- tetrahydronorharman-1-one（2）、19--methyl-3,14- dihydroangustoline（3）、latifoliamide B（4）、latifoliamide D（5）、bacilsubteramide A（6）、vinmajine I（7）、naucleofficine D（8）、1-甲氧甲酰-β-咔巴啉（1-carbomethoxy-β-carboline，9）、naphthisoxazol A（10）、1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（11）、rubiadin-1-methyl ether（12）、1,3,6- trihydroxy-2-methoxy methyl-9,10-anthraquinone（13）、3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-9,10- anthraquinone（14）、7-羟基色原酮（7-hydroxy chromone，15）、5,7-二羟基色原酮（5,7-dihydroxy chromone，16）、6,4ʹ-dihydroxy-3ʹ-methoxyaurone（17）和farnisin（18）。所有化合物均为首次从虎刺属植物中分离得到。此外，采用MTS法通过对分离鉴定化合物的体外抑制滑膜细胞增殖的活性进行检测评价了化合物1～18的抗类风湿性关节炎活性。结果表明化合物11～14、17和18表现出较为显著的抗类风湿性关节炎活性，对滑膜成纤维MH7A细胞增殖抑制活性的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L

1 仪器与材料

Bruker AV-400型超导核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Finnigan LCQ Advantange MAX型质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；UltiMate 3000制备型HPLC仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent1200分析型HPLC仪（美国Agilent Technologies有限公司）；Waters XBridge C18分析型HPLC色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司）和Waters XBridge C18制备型HPLC色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm，美国Waters公司）；Sepacore型中低压制备色谱（瑞士Buchi公司）；N-1001型旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；反相硅胶色谱材料（德国Merck公司）；Sephadex LH-20凝胶（美国Amersham Blosclences公司）；薄层硅胶GF254和柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；XPR105DR/AC电子天平（瑞士METTLER TOLEDO仪器有限公司）；YOKO-ZX型紫外分析暗箱（武汉药科新技术开发有限公司）；HERAcell 240i型CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific有限公司）；OLYM PUS-IX70型生物倒置显微镜（日本Olympus株式会社）；BHC-1300B2型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Tecan Infinite Pro型全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan集团公司）；F12培养基、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶、胎牛血清和双抗（美国Thermo Fisher Scientific有限公司）；噻唑蓝（德国Merck公司）；MH7A细胞来源于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）细胞库，购自于上海冠导生物工程有限公司。所用试剂均为色谱纯或分析纯试剂（西陇化工股份有限公司）。甲氨蝶呤片（上海信谊药厂有限公司；国药准字H31020644；批号036141008）。

海南虎刺枝叶于2018年11月采集于海南省昌江黎族自治县霸王岭国家森林公园，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯教授鉴定为茜草科虎刺属植物海南虎刺(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan的枝叶，凭证标本（HNDAHA20181102）保存于海南师范大学南药资源产业化关键技术研究海南省工程研究中心植物标本室。

2 提取与分离

将阴干的海南虎刺枝叶21.8 kg粉碎后用甲醇室温浸泡提取5次，每次室温浸泡提取3 d，合并提取液，减压回收甲醇后得总浸膏2.26 kg。甲醇总浸膏加蒸馏水混悬，依次用石油醚和醋酸乙酯各萃取5次，减压回收溶剂后得石油醚萃取部位632.8 g和醋酸乙酯萃取部位508.2 g。石油醚萃取部位（630.0 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯体系为洗脱剂（90∶10～20∶80）进行梯度洗脱，得到8个流分Fr. 1～8。Fr. 4（68.9 g）经反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-水体系为洗脱剂（60∶40～100∶0）进行梯度洗脱，得到9个亚流分（Fr. 4A～4I）。Fr. 4B（6.3 g）经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮体系为洗脱剂（90∶10～50∶50）进行梯度洗脱，再经制备型HPLC制备（甲醇-水78∶22）得到化合物1（21.2 mg）、7（8.9 mg）、9（11.3 mg）和12（102.8 mg）；Fr. 4C（5.8 g）经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮为洗脱剂（85∶15～40∶60）进行梯度洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（丙酮）纯化后，再经制备型HPLC制备［乙腈-水（73∶17）］得到化合物2（24.6 mg）、10（33.5 mg）、13（72.3 mg）、14（53.8 mg）和16（46.3 mg）；Fr. 5（48.7 g）经反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-水体系为洗脱剂（60∶40～100∶0）进行梯度洗脱，得到6个亚流分（Fr. 5A～5F）；Fr. 5B（8.1 g）经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-丙酮（65∶35～25∶75）进行梯度洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化后，再经制备型HPLC制备（乙腈-水56∶44）得到化合物3（7.6 mg）、4（86.3 mg）、15（93.4 mg）和17（52.8 mg）；Fr. 5C（7.2 g）经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮为洗脱剂（75∶25～30∶70）进行梯度洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（丙酮）纯化后，再经制备型HPLC制备［甲醇-水（63∶37）］得到化合物5（15.8 mg）、6（5.6 mg）、8（35.6 mg）、11（73.9 mg）和18（52.8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C20H20N2O3，ESI-MS/: 337.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.21 (1H, brs, H-1), 9.58 (1H, d,= 3.8 Hz, H-18), 7.37 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.34 (1H, s, H-17), 7.30 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.06 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 7.00 (1H, dd,= 8.0, 7.7 Hz, H-10), 5.01 (1H, m, H-5α), 4.79 (1H, m, H-3), 4.10 (1H, m, H-19), 3.01 (1H, m, H-6α), 2.75 (1H, m, H-6β), 2.70 (1H, m, H-5β), 2.68 (1H, m, H-14α), 2.65 (1H, m, H-20), 2.29 (1H, m, H-15), 1.91 (1H, m, H-14β), 1.36 (1H, d,= 1.8 Hz, H-21)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d): 203.0 (C-18), 163.7 (C-22), 150.0 (C-17), 136.1 (C-13), 134.2 (C-2), 126.9 (C-8), 120.9 (C-11), 118.8 (C-10), 117.8 (C-9), 111.6 (C-12), 100.0 (C-16), 107.7 (C-7), 71.1 (C-19), 56.2 (C-20), 52.9 (C-3), 42.8 (C-5), 28.5 (C-14), 27.7 (C-15), 19.9 (C-6), 18.9 (C-21)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[10]，故鉴定化合物1为naucleidinal。

化合物2：白色无定形粉末，改良碘化铋钾反应阳性；C11H10N2O，ESI-MS/: 187.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.61 (1H, s, -NH), 7.56 (1H, brs, H-2), 7.62 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.40 (1H, d,= 8.0 Hz, H-8), 7.18 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-7), 7.08 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-6), 3.49 (2H, t,= 6.8 Hz, H-3), 2.89 (2H, t,= 6.8 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 162.0 (C-1), 137.1 (C-8a), 127.3 (C-1a), 125.0 (C-5a), 124.1 (C-7), 120.1 (C-5), 119.4 (C-6), 117.9 (C-4a), 112.5 (C-8), 41.2 (C-3), 20.4 (C-4)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[11]，故鉴定化合物2为1,2,3,4- tetrahydronorharman-1-one。

化合物3：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C21H21N3O2，ESI-MS/: 348.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.19 (1H, s, H-1), 9.10 (1H, s, H-17), 8.69 (1H, s, H-21), 7.55 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.47 (1H, d,= 8.0 Hz, H-12), 7.22 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 7.11 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-10), 5.15 (1H, d,= 10.2 Hz, H-19), 5.07 (1H, m, H-5β), 4.01 (1H, m, H-14β), 4.79 (1H, m, H-3), 3.38 (3H, s, 18-OCH3), 3.02 (1H, m, H-5α), 2.96 (1H, m, H-6), 2.85 (1H, m, H-14α), 1.55 (1H, m, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 162.8 (C-22), 150.1 (C-21), 147.9 (C-17), 143.1 (C-15), 136.4 (C-13), 135.0 (C-20), 132.9 (C-2), 126.2 (C-8), 124.3 (C-16), 121.4 (C-11), 118.8 (C-10), 118.0 (C-9), 111.2 (C-12), 107.4 (C-7), 74.3 (C-19), 56.4 (C-3), 50.7 (18-CH3), 38.8 (C-5), 30.0 (C-14), 22.3 (C-6), 20.5 (C-18)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[12]，故鉴定化合物2为19--methyl- 3,14-dihydroangustoline。

化合物4：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C21H24N2O3，ESI-MS/: 353.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.22 (1H, s, H-1), 7.50 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.29 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.15 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-10), 7.10 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 5.68 (1H, q,= 7.2 Hz, H-19), 5.06 (1H, dd,= 4.8, 3.8 Hz, H-3), 5.01 (1H, s, H-21), 4.87 (1H, m, H-5α), 4.19 (1H, d,= 11.8 Hz, H-17α), 3.68 (1H, d,= 11.8 Hz, H-17β), 2.87 (1H, m, H-5β), 2.81 (1H, m, H-6α), 2.74 (1H, dd,=10.2, 4.8 Hz, H-15), 2.68 (1H, m, H-6β), 2.63 (1H, m, H-14α), 2.58 (1H, m, H-14β), 1.72 (1H, d,= 7.2 Hz, H-18), 1.51 (3H, s, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 161.7 (C-22), 137.9 (C-2), 136.2 (C-13), 135.2 (C-20), 127.1 (C-8), 126.9 (C-19), 120.6 (C-11), 118.8 (C-10), 116.8 (C-7), 111.6 (C-12), 106.7 (C-9), 73.6 (C-21), 69.5 (C-16), 54.3 (C-3), 39.8 (C-5), 35.9 (C-15), 26.4 (C-14), 20.9 (C-18), 20.5 (C-6), 19.6 (C-1′)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[13]，故鉴定化合物4为latifoliamide B。

化合物5：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C19H17N3O，ESI-MS/: 304.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.78 (1H, s, H-1), 9.23 (1H, s, H-17), 8.69 (1H, s, H-21), 7.40 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.29 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-12), 7.05 (1H, dd,= 7.8 Hz, H-10), 7.01 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 5.21 (1H, dd,= 4.8, 3.6 Hz, H-3), 4.81 (1H, m, H-5α), 3.29 (1H, m, H-14α), 2.98 (1H, m, H-14β), 2.95 (1H, m, H-5β), 2.89 (1H, m, H-6α), 2.68 (1H, m, H-6β), 2.17 (1H, s, H-19)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 165.9 (C-22), 150.8 (C-17), 148.1 (C-21), 138.6 (C-15), 134.9 (C-20), 134.3 (C-13), 126.8 (C-8), 126.6 (C-2), 119.3 (C-16), 118.3 (C-11), 117.5 (C-10), 116.3 (C-9), 114.3 (C-12), 111.2 (C-7), 53.5 (C-3), 42.1 (C-5), 28.6 (C-14), 20.2 (C-6), 18.1 (C-19)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[13]，故鉴定化合物5为latifoliamide D。

化合物6：白色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C12H14N2O3，ESI-MS/: 235.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.29 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.23 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-7), 7.06 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-6), 6.89 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 3.09 (2H, dt,= 8.2, 4.2 Hz, H-11), 2.08 (2H, dt,= 8.2, 4.2 Hz, H-10), 1.78 (3H, s, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 182.0 (C-2), 172.9 (C-1′), 142.8 (C-9), 132.6 (C-4), 130.8 (C-7), 125.3 (C-5), 124.0 (C-6), 111.6 (C-8), 76.6 (C-3), 38.0 (C-10), 35.6 (C-11), 22.6 (C-2′)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[14]，故鉴定化合物6为bacilsubteramide A。

化合物7：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾反应阳性；C20H17N3O2，ESI-MS/: 332.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.91 (1H, br s, H-1), 9.19 (1H, s, H-17), 8.75 (1H, s, H-21), 7.60 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.48 (1H, d,= 8.0 Hz, H-12), 7.19 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 7.16 (1H, s, H-14), 7.02 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-10), 5.61 (1H, s, 19-OH), 5.32 (1H, m, H-19), 4.35 (2H, m, H-5), 3.10 (2H, m, H-6), 1.51 (1H, d,= 6.0 Hz, 3H, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.9 (C-22), 148.8 (C-17), 147.2 (C-21), 138.5 (C-15), 138.1 (C-13), 136.2 (C-3), 134.6 (C-20), 127.5 (C-2), 125.1 (C-8), 124.2 (C-11), 119.6 (C-10), 119.3 (C-9), 118.4 (C-16), 114.2 (C-7), 111.6 (C-12), 93.5 (C-14), 63.6 (C-19), 39.9 (C-5), 24.8 (C-18), 18.9 (C-6)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[15]，故鉴定化合物7为vinmajine I。

化合物8：淡黄色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C20H22N2O3，ESI-MS/: 339.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.12 (1H, s, H-1), 7.39 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.29 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.07 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 7.01 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-10), 6.54 (1H, d,= 4.2 Hz, 17-OH), 5.38 (1H, q,= 7.2 Hz, H-19), 5.27 (1H, t,= 4.2 Hz, H-17), 5.05 (1H, d,= 5.8 Hz, H-3), 4.78 (1H, dd,= 12.8, 5.8 Hz, H-5α), 4.64 (1H, d,= 12.8 Hz, H-21α), 3.67 (1H, d,= 12.8 Hz, H-21β), 3.01 (1H, dd,= 12.8, 4.8 Hz, H-5β), 2.89 (1H, td,= 13.6, 6.8 Hz, H-14α), 2.78 (1H, m, H-6α), 2.69 (1H, m, H-15), 2.58 (1H, dd,= 15.2, 14.6 Hz, H-6β), 2.39 (1H, dd,= 8.2, 5.8 Hz, H-16), 2.25 (1H, d,= 13.6 Hz, H-14β), 1.48 (3H, d,= 7.2 Hz, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.0 (C-22), 135.6 (C-13), 134.9 (C-2), 134.8 (C-20), 126.9 (C-8), 120.6 (C-11), 119.4 (C-19), 118.6 (C-10), 117.6 (C-9), 111.5 (C-12), 109.0 (C-7), 91.0 (C-17), 60.1 (C-21), 53.7 (C-3), 42.6 (C-5), 46.3 (C-16), 28.5 (C-15), 26.9 (C-14), 20.6 (C-6), 11.7 (C-18)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[16]，故鉴定化合物8为naucleofficine D。

化合物9：白色无定形粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C13H10N2O2，ESI-MS/: 227.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.39 (1H, d,= 4.8 Hz, H-3), 8.31 (1H, d,= 4.8 Hz, H-4), 8.19 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.68 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-6), 7.56 (1H, d,= 8.0 Hz, H-8), 7.28 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-7), 4.08 (3H, s, 1-COOCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 167.4 (1-COOCH3), 143.4 (C-1), 139.0 (C-3), 138.1 (C-13), 133.8 (C-10), 130.8 (C-12), 130.6 (C-6), 123.0 (C-5), 121.8 (C-7), 121.7 (C-11), 120.1 (C-4), 113.5 (C-8), 52.9 (1-COOCH3)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[17]，故鉴定化合物9为1-甲氧甲酰-β-咔巴啉。

化合物10：白色无定型粉末，改良碘化铋钾显色反应阳性；C11H9NO2，ESI-MS/: 188.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.33 (1H, d,= 7.8 Hz, H-8), 7.21 (1H, s, H-4), 7.09 (1H, dd,= 7.8, 7.6 Hz, H-7), 7.04 (1H, dd,= 8.0, 7.6 Hz, H-6), 3.86 (1H, dd,= 10.0, 4.2 Hz, H-9a), 3.52 (1H, dd,= 14.8, 4.2 Hz, H-9β), 3.15 (1H, dd,= 14.8, 10.0 Hz, H-9α)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 174.5 (C-3), 138.6 (C-8a), 128.6 (C-4a), 125.3 (C-8), 123.0 (C-7), 119.9 (C-6), 119.3 (C-5), 112.5 (C-4), 109.7 (C-3a), 56.8 (C-9a), 28.6 (C-9)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[18]，故鉴定化合物10为naphthisoxazol A。

化合物11：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C15H10O4，ESI-MS/: 255.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 13.22 (1H, brs, 1-OH), 10.03 (1H, brs, 6-OH), 8.21 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 7.68 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 7.63 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3), 7.58 (1H, d,= 2.2 Hz, H-5), 7.29 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-7), 2.28 (3H, s, 2-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 188.9 (C-9), 182.6 (C-10), 164.4 (C-1), 161.5 (C-6), 135.3 (C-3), 132.7 (C-2), 130.8 (C-8), 137.7 (C-9a), 137.2 (C-4a), 127.7 (C-8a), 121.9 (C-7), 119.6 (C-4), 116.0 (C-10a), 113.6 (C-5), 15.8 (2-CH3)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[19]，故鉴定化合物11为1,6- dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone。

化合物12：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C16H12O4，ESI-MS/: 269.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.12 (1H, s, 3-OH), 8.16 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 8.10 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.91 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-7), 7.79 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-6), 7.48 (1H, s, H-4), 3.81 (3H, s, 1-OCH3), 2.16 (3H, s, 2-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.7 (C-10), 179.9 (C-9), 161.5 (C-3), 160.4 (C-1), 134.6 (C-4a), 134.4 (C-7), 133.8 (C-10a), 133.4 (C-6), 131.9 (C-8a), 126.7 (C-8), 125.9 (C-2), 125.8 (C-5), 118.0 (C-9a), 108.9 (C-4), 60.7 (1-OCH3), 8.9 (2-CH3)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[20]，故鉴定化合物12为rubiadin-1-methyl ether。

化合物13：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C16H12O6，ESI-MS/: 301.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 13.48 (1H, brs, 1-OH), 9.79 (1H, brs, 3-OH), 8.18 (1H, d,= 8.4 Hz, H-8), 7.58 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5), 7.28 (1H, dd,= 8.2, 2.4 Hz, H-7), 7.25 (1H, s, H-4), 4.72 (2H, s, H2-11), 3.39 (3H, s, 11-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 187.1 (C-9), 182.6 (C-10), 164.2 (C-1), 164.1 (C-3), 163.9 (C-6), 135.5 (C-4a), 130.3 (C-8), 122.2 (C-7), 136.5 (C-10a), 126.5 (C-8a), 117.5 (C-2), 113.4 (C-5), 110.2 (C-9a), 108.4 (C-4), 64.2 (C-11), 58.5 (11-OCH3)。以上波谱数据与文献报道波谱数据基本一致[21]，故鉴定化合物12为1,3,6-trihydroxy-2- methoxymethyl-9,10-anthraquinone。

化合物14：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C15H10O5，ESI-MS/: 271.1 [M＋H]+1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.18 (1H, s, H-1), 7.99 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 7.52 (1H, s, H-4), 7.43 (1H, d,= 2.3 Hz, H-5), 7.17 (1H, dd,= 8.2, 2.3 Hz, H-7), 4.60 (2H, s, H2-11)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 183.0 (C-10), 180.8 (C-9), 162.8 (C-6), 159.4 (C-3), 136.2 (C-2), 135.3 (C-10a), 133.4 (C-9a), 125.1 (C-4a), 129.7 (C-8), 125.9 (C-1), 125.3 (C-8a), 121.3 (C-7), 112.1 (C-5), 111.2 (C-4), 55.9 (C-11)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[21]，故鉴定化合物14为3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl- 9,10-anthraquinone。

化合物15：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C9H6O3，ESI-MS/: 163.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.01 (1H, d,= 5.8 Hz, H-2), 7.92 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd,= 8.6, 1.9 Hz, H-6), 6.76 (1H, d,= 1.9 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 5.8 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 179.6 (C-4), 165.3 (C-7), 159.9 (C-9), 157.6 (C-2), 128.0 (C-5), 118.1 (C-10), 116.7 (C-6), 112.8 (C-3), 103.6 (C-8)。以上波谱数据与文献报道的7-羟基色原酮的波谱数据基本一致[22]，故鉴定化合物15为7-羟基色原酮。

化合物16：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C9H6O4，ESI-MS/: 179.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.02 (1H, d,= 6.3 Hz, H-2), 6.38 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8), 6.23 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6), 6.19 (1H, d,= 6.3 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 183.5 (C-4), 166.3 (C-7), 163.6 (C-5), 160.0 (C-9), 157.9 (C-2), 111.7 (C-3), 106.5 (C-10), 99.9 (C-6), 94.8 (C-8)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[23]，故鉴定化合物16为5,7-二羟基色原酮。

化合物17：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C16H12O5，ESI-MS/: 285.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.62 (1H, d,= 8.2 Hz, H-4), 7.48 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2ʹ), 7.38 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6ʹ), 6.90 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5ʹ), 6.73 (1H, s, H-10), 6.69 (1H, d,= 2.0 Hz, H-7), 6.66 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-5), 3.89 (3H, s, 3ʹ-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 184.3 (C-3), 170.0 (C-6), 168.2 (C-8), 150.3 (C-4ʹ), 149.1 (C-3ʹ), 148.0 (C-2), 127.5 (C-4), 127.0 (C-6ʹ), 116.6 (C-5), 125.3 (C-1ʹ), 115.4 (C-2ʹ), 114.7 (C-10), 114.3 (C-5ʹ), 113.9 (C-9), 99.3 (C-7), 56.3 (3ʹ-OCH3)。以上波谱数据与文献报道的波谱数据基本一致[24]，故鉴定化合物17为6,4ʹ-dihydroxy-3ʹ-methoxyaurone。

化合物18：淡黄色无定形粉末，三氯化铁显色反应阳性；C16H12O5，ESI-MS/: 285.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.01 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 7.52 (1H, dd,= 8.0, 2.2 Hz, H-6ʹ), 7.48 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2ʹ), 7.01 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8), 6.93 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5ʹ), 6.89 (1H, dd,= 8.6, 1.8 Hz, H-6), 6.68 (1H, s, H-3), 4.02 (3H, s, 4ʹ-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 180.2 (C-4), 166.0 (C-2), 164.9 (C-7), 159.8 (C-9), 152.0 (C-4ʹ), 149.6 (C-3ʹ), 127.8 (C-5), 123.9 (C-1ʹ), 121.7 (C-6ʹ), 117.3 (C-10), 117.0 (C-5ʹ), 116.5 (C-6), 110.7 (C-2ʹ), 105.6 (C-3), 103.6 (C-8), 56.8 (4ʹ-OCH3)。以上波谱数据与文献中报道的波谱数据基本一致[25]，故鉴定化合物18为farnisin。

4 抗类风湿性关节炎活性评价

以MH7A细胞为活性评价细胞株，采用MTS法对分离鉴定的18个化合物的体外抑制MH7A细胞增殖活性进行测试，以初步评价分离得到的18个化合物的抗类风湿性关节炎活性，研究中以甲氨蝶呤为阳性对照药物，具体的活性评价实验操作流程和操作方法见本课题组前期研究报道[26-28]。

活性评价结果表明蒽醌类化合物11～14以及黄酮类化合物17和18对MH7A细胞表现出了较为显著的生长抑制活性，对MH7A细胞增殖的抑制活性的IC50值为（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L，分离得到的生物碱类化合物和色原酮类类化合物未表现出明显的抑制滑膜细胞生长的活性（IC50＞300.00 μmol/L）。值得一提的是，蒽醌类化合物11～14以及黄酮类化合物17表现出了优于阳性对照药物甲氨蝶呤对MH7A细胞的生长抑制活性，提示其具有显著的体外抗类风湿性关节炎活性，具体活性评价结果数据见表1。

表1 部分化合物抑制MH7A细胞生长的活性()

5 讨论

本研究综合运用多种色谱分离方法和波谱鉴定技术对茜草科虎刺属植物海南虎刺枝叶的甲醇提取物中的化学成分进行了系统研究，从中分离鉴定了18个化合物，包括10个生物碱类化合物、4个蒽醌类化合物、2个色原酮类化合物以及2个黄酮类化合物，所有化合物均为首次从虎刺属植物中分离得到。通过对所有分离得到的化合物1～18的体外抑制MH7A细胞增殖活性评价发现分离鉴定的蒽醌类化合物11～14以及黄酮类化合物17和18表现出了较为显著的抗类风湿性关节炎活性，提示蒽醌类化合物以及黄酮类化合物可能是海南虎刺具有抗类风湿性关节炎作用的药效物质基础。本研究不仅可为新型天然来源的抗类风湿性关节炎新药的开发提供重要的技术支撑，而且可为海南特有植物海南虎刺植物资源的合理开发与利用提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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LAN Chuang1, XIE Zhen1, SHI Ni-fei1, FU Yong-quan1, XIONG Shu-hong1, LIU Yan-ping1, 2, 3, FU Yan-hui1, 2, 3

1. Key Laboratory of Tropical Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education, Hainan Normal University, Haikou 571126, China 2. Engineering Research Center for Industrialization of Southern Medicinal Plants Resources of Hainan Province, Hainan Normal University, Haikou 571126, China 3. Key Laboratory of Southern Medicinal Plants Resources of Haikou City, Hainan Normal University, Haikou 571126, China

To study the chemical constituents in the stems and leaves of Hainanhuci ()and their anti-rheumatoid arthritis activities.The chemical constituents in the stems and leaves ofwere isolated and purified by silica gel, ODS, Sephadex LH-20 gel column chromatographies and preparative HPLC. The chemical structures of all isolates were identified using physicochemical properties, spectroscopic analyses, as well as the comparisons with the reported data in literature. In addition, all isolates were evaluated for their anti-rheumatoid arthritis activities using MTS method,measuring their anti-proliferative effects on synoviocytes.A total of 18 compounds were isolated from the methanol extract of the stems of, which were identified as naucleidinal (1), 1,2,3,4-tetrahydronorharman-1-one (2), 19--methyl-3,14-dihydro angustoline (3), latifoliamide B (4), latifoliamide D (5), bacilsubteramide A (6), vinmajine I (7), naucleofficine D (8), 1-carbomethoxy-β-carboline (9), naphthisoxazol A (10), 1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone (11), rubiadin-1-methyl ether (12), 1,3,6-trihydroxy-2-methoxymethyl-9,10-anthraquinone (13), 3,6-dihydroxy-2-hydroxy methyl-9,10-anthraquinone (14), 7-hydroxychromone (15), 5,7-dihydroxychromone (16), 6,4ʹ-dihydroxy-3ʹ-methoxyaurone (17), and farnisin (18). Compounds 11–14, 17 and 18 displayed the inhibitory effects on the proliferation of MH7A synovial fibroblast cells with the IC50values in range of (8.93 ± 0.09) to (152.58 ± 0.32) μmol/L.All compounds are isolated from the genusfor the first time, and compounds 11–14, 17 and 18 exhibited remarkable anti-rheumatoid arthritis activities.

(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan; naucleidinal; rubiadin-1-methyl ether; farnisin; anti-rheumatoid arthritis activities

R284.1

A

0253 - 2670(2022)24 - 7656 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.002

2022-08-16

海南省自然科学基金项目（220RC596，222RC655，2019RC198）；国家自然科学基金项目（21967008）；国家自然科学基金项目（32070390）；国家自然科学基金项目（22067005）；海南省重点研发专项（ZDYF2022SHFZ028）；海口市重点研发计划项目（2020054，2017050）；海南省省级大学生创新训练项目（S202211658025，S202211658028）；海南师范大学校级大学生创业实践项目（HSRS21-037）

蓝 创，男，硕士研究生，主要从事活性天然产物的发现与应用研究工作。E-mail: 05jilunwen@163.com

刘艳萍，研究员，硕士生导师，主要从事天然活性物质的发现及其作用机制研究工作。E-mail: liuyanpinghs@163.com

付艳辉，教授，博士生导师，主要从事天然活性物质的发现与应用研究工作。E-mail: fuyanhui80@163.com

[责任编辑 王文倩]