2,4-表油菜素内酯对高温胁迫下金线莲的影响
2022-12-28叶巧玲董向阳颜丹红屈雨晨刘永立胡海涛
叶巧玲,董向阳,颜丹红,屈雨晨,刘永立,胡海涛*
(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004; 2.玉环市农业农村和水利局,浙江 台州 317600;3.浙江大学 新农村研究院,浙江 杭州 310058)
金线莲又名金线兰、金丝草、金不换等,为兰科开唇兰属多年生草本植物,是我国传统名贵药材,具有较高的药用价值,在民间素有“金草”“神药”“乌人参”等美称[1]。现代药理研究表明,金线莲具有抗肿瘤、降血糖、保肝、抗HBV和降血压等功效,药用价值和保健功能显著,市场开发价值极高[2-3]。近年来,金线莲的市场需求量巨大,价格居高不下,人工栽培是解决其供需矛盾的唯一途径。金线莲喜阴凉、潮湿的环境,适宜生长温度为18~25 ℃,南方夏季35 ℃以上的高温严重影响人工栽培金线莲的产量[4],虽然大棚栽培可以通过密闭水帘等方式降温,但运行成本较高。因此,南方夏季高温已成为制约金线莲人工栽培产业推广、发展的瓶颈,寻找缓解高温胁迫的有效途径是目前金线莲人工栽培生产中急需解决的问题。迄今为止,仅林晓红等[4]对高温胁迫下金线莲叶绿素荧光参数、SOD活性及电导率等生理指标进行了初步研究,未见有关缓解金线莲夏季高温胁迫的相应解决措施的报道。
油菜素甾醇类(BRs)是已公认的第六大类植物激素,具有促进细胞伸长和分裂、促进光合作用、提高植物抗逆性等作用[5]。大量研究[5-6]表明,BRs能有效提高植物的抗热、抗寒、抗渍和抗旱等能力。吴进东等[7]研究了油菜素内酯对霍山石斛耐热性的影响,发现外源喷施BR可以显著增强霍山石斛耐热性,缓解高温胁迫对霍山石斛的伤害。陆兵等[8]发现外源EBR(2,4-表油菜素内酯)可以通过提高浙贝母叶片可溶性蛋白、叶绿素含量和抗氧化酶活性,来降低体内活性氧水平,进而提高浙贝母的耐热性。张永平等[9]研究了EBR对高温胁迫下甜瓜幼苗生理及光合特性的影响,结果表明,EBR处理显著促进甜瓜幼苗生长,有利于高温胁迫下抗氧化酶系统的维持和对光能的捕获与转换。目前,有关EBR对高温胁迫下金线莲耐热性影响的研究鲜有报道。本文研究了EBR对高温胁迫下金线莲叶片中活性氧代谢及抗氧化系统的影响,以期为利用EBR缓解夏季高温胁迫对金线莲产生的危害提供理论和生产依据。
1 材料与方法
1.1 材料培养
试验于2019年5—9月在浙江师范大学植物分子生理学实验室进行。首先选取生长势一致的金线莲组培苗,以泥炭土为栽培基质进行定植,然后放入智能光照培养箱中培养4周;培养温度为(25±1) ℃/(20±1)℃(昼/夜),光周期12 h/12 h(昼/夜),光照强度4 000 lx,相对湿度保持在70%~80%。
高温处理前,先分别用1.0 μmol·L-1EBR、蒸馏水(均含0.02% Tween 20)喷施金线莲植株,每株50 mL,连续喷洒4 d,使金线莲苗充分吸收EBR。4 d后进行温度处理,试验设4个处理组合,每个处理50株:常温喷蒸馏水、常温喷EBR、高温胁迫喷蒸馏水、高温胁迫喷EBR。培养箱参数:常温处理为(25±1) ℃/(20±1)℃(昼/夜),高温胁迫处理为(35±1) ℃/(30±1)℃(昼/夜),除温度处理不同,光强、湿度等其他因素均保持一致。高温胁迫6 d后剪取金线莲叶片进行各项指标的测定。处理编号:常温喷施蒸馏水,Normal temperature(NT);常温喷施EBR,Normal temperature+EBR(BRNT);高温喷施蒸馏水,Heat temperature+H2O2(HT);高温喷施EBR,Heat temperature+EBR(BRHT)。
1.2 指标测定
1.2.1 活性氧测定
1.2.2 抗氧化剂测定
参照Costa等[12]的方法测定还原型抗坏血酸和总抗坏血酸的含量。测定D525,含量以mg·g-1表示。总抗坏血酸(AsA+DHA)含量通过被二硫苏糖醇还原后的AsA测定,氧化型抗坏血酸(DHA)含量=总抗坏血酸-还原型抗坏血酸(AsA)。
GSH和总谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量测定参考Anderson等[13]的方法。测定D412值,含量以mg·g-1表示。
1.2.3 抗氧化酶活性测定
SOD活性测定参照Stewart等[14]的方法,采用氮蓝四唑(NBT)光还原法,将抑制NBT光还原的50%作为1个酶活单位(U),酶活性以U·g-1表示。CAT活性测定参照Aebi的方法[15],将D240每分钟减少0.1作为1个酶活单位(U),酶活性以U·g-1表示。采用Jiang等[16]的方法提取AsA-GSH循环酶。分别参照Nakano等[17]、Hossain等[18]、Foyer等[19]的方法,检测APX、DHAR、MDHAR、GR的活性。APX和DHAR以D265每分钟减少0.1作为1个酶活单位,酶活性均以U·g-1·min-1表示,GR和MDHAR以D340每分钟减少0.01作为1个酶活单位。
1.3 数据分析
各指标测定重复3次,取平均值,使用SPSS软件对平均数进行Duncan’s多重比较,分析差异显著性,再用Origin软件绘图。
2 结果与分析
2.1 对金线莲和H2O2含量的影响
表1 外源EBR处理对金线莲产生速率和H2O2含量的影响
2.2 对金线莲SOD和CAT活性的影响
柱上无相同小写字母表示组间差异达显著水平(P<0.05),图2~4同。图1 外源EBR处理对金线莲SOD、CAT活性的影响
2.3 对金线莲抗坏血酸循环的影响
在AsA-GSH循环中,AsA含量、氧化还原状态(AsA/DHA)比值与抗逆性呈正相关[20]。AsA通过APX酶参与清除细胞内的H2O2,以此减轻胁迫(高温、低温、盐碱、紫外线等)下引发的氧化胁迫,植株内AsA的含量及AsA/DHA比值在一定程度上能够反映植物的抗逆性强弱。在正常条件下,单独EBR处理对AsA、DHA含量以及AsA/DHA比值无明显影响(图2)。与对照相比,高温胁迫使金线莲叶片AsA含量显著下降,DHA含量升高;AsA/DHA比值与AsA含量变化趋势一样,显著下降。而高温胁迫下喷施外源EBR后,金线莲叶片内AsA含量比未喷施组显著增加,AsA/DHA比值也显著提高;相反,DHA的含量显著下降。由此说明,连续6 d的高温胁迫下,AsA再生能力减弱,细胞氧化还原力降低,抗氧化能力下降,而外源EBR处理可以显著提高金线莲叶片内AsA含量及AsA/DHA比值,从而增强植株的抗逆能力。
图2 外源EBR处理对金线莲叶片中AsA和DHA含量的影响
2.4 对金线莲谷胱甘肽循环的影响
GSH是AsA-GSH循环系统中重要的抗氧化剂,GSH可直接与活性氧自由基反应,并由GSH转变为GSSG,GR利用NADPH的电子将GSSG还原为GSH,从而使细胞内谷胱甘肽库保持在还原状态,增强植物对逆境的抵抗力。正常温度下EBR处理对GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG比值无明显影响,而高温胁迫下,GSH含量显著下降,GSSG显著上升,GSH/GSSG比值显著下降;高温胁迫下,外源EBR处理较未喷施组显著提高金线莲叶片中GSH含量及GSH/GSSG比值,而且GSSG含量较对照显著下降,其中GSH含量显著上升(图3)。外源EBR处理显著提高了GSH含量及GSH/GSSG,表明外源EBR处理有利于维护谷胱甘肽系统的稳定性。
图3 外源EBR处理对高温胁迫下金线莲叶片中GSH和GSSG含量的影响
2.5 对金线莲AsA-GSH循环相关酶活性的影响
与常温相比,高温胁迫处理下金线莲叶片中APX活性显著下降,而外源EBR处理比未喷施显著提高了金线莲叶片中APX活性,从而保证H2O2可以被及时清除(图4)。AsA-GSH循环的运转效率与MDHAR、DHAR、GR等酶的活性密切相关,这些酶参与了AsA-GSH循环中AsA的再生。AsA被氧化形成MDHA,MDHA在MDHAR的作用下再生成AsA,或通过非酶促歧化形成DHA,在DHAR参与下DHA可以再生形成AsA。植株AsA-GSH循环酶并不直接作用于活性氧物质,其作用机制主要是为了保持体内抗氧化物质AsA、GSH的还原性,与H2O2的清除密切相关。在正常条件下,EBR处理对MDHAR、DHAR、GR活性无显著影响。高温胁迫导致金线莲叶片中MDHAR、DHAR、GR等酶活性比对照均显著降低,而外源EBR处理可以使金线莲叶片中AsA-GSH循环中MDHAR、DHAR、GR的活性均显著提高。由此可见,外源的EBR处理可以通过提高金线莲叶片中MDHAR、DHAR、GR的活性,保证其体内AsA含量水平,从而增强金线莲的抗高温能力。
图4 外源EBR处理对金线莲叶片APX、MDHAR、DHAR、GR活性的影响
3 讨论
综上所述,高温胁迫下,喷施适宜浓度的外源EBR可以激活金线莲的活性氧防御系统,从而增加活性氧清除能力,降低了ROS积累水平,进而减轻了高温胁迫对金线莲组织细胞的损伤程度,增强金线莲植株抵抗高温胁迫的能力。