绣球菌水提物的免疫促进作用

吕国英，王富根，李云涛，张作法*

(1.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千岛秀菇生物科技有限公司，浙江 淳安 311701；3.常山豪锋农业开发有限公司，浙江 常山 324200)

绣球菌隶属于担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、绣球菌科，是一种珍稀的特色食药用菌。绣球菌口感脆嫩清香，含有丰富的营养物质，被称为“万菇之王”。绣球菌富含β-葡聚糖，据报道，绣球菌中葡聚糖含量达到47.7%[1]。另外氨基酸种类齐全，其中以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量较高。另外，绣球菌中含有丰富的维生素，其中VB3和VE含量居菌藻类食物前列[2]。

丰富的营养物质赋予了绣球菌卓越的药理活性，据报道绣球菌在抗肿瘤[3]、降血糖[4]、保护神经[5]、保护肠胃[6]及美容[7]方面具有很好的药理作用。目前，绣球菌在我国主要作为食材，相关功能产品的种类很少，本实验通过研究绣球菌提取物的免疫促进作用，为其深加工产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

绣球菌水提物，由杭州千岛湖颇益农产品专业合作社联合社提供；临用前以饮用水配成相应浓度(7.5、15和30 mg·mL-1)，按20 mL·kg-1灌胃给药。人参水煎液的制备：生晒参(华东医药股份有限公司)，粉碎后加10倍量水，浸泡30 min，煎煮提取1 h，滤过，滤渣加8倍量水，煎煮提取0.5 h，滤过，滤渣加6倍量水，煎煮提取0.5 h，滤过，合并滤液，水浴浓缩至生药含量为0.1 g·mL-1的人参水煎液，4～8 ℃冷藏保存，作为免疫试验的阳性对照用药。

环磷酰胺针(安道生)，规格为每支0.2 g(批号7F174A，德国Baxter Oncology GmbH)，临用时用生理盐水稀释。噻唑蓝(MTT，ST316)购自碧云天；刀豆蛋白ConA购自Solarbio公司(C8110)；RPMI1640培养基购自Gibco公司(8117008)；胎牛血清购自四季青；红细胞裂解液为自配(配方：NH4Cl 0.373 5 g，Tris 0.13 g，溶于50 mL双蒸水，0.22 μm过滤除菌后使用)。

1.2 动物及饲养环境

ICR雄性小鼠，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2014-0001。饲养于浙江省农业科学院动物房(清洁级)，温度18～24 ℃，相对湿度60%～80%，全价颗粒饲料来源于浙江省实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 对非特异性免疫功能方面的影响

雄性ICR小鼠60只，体重18～22 g，适应性喂养3 d后，随机分为正常对照、模型对照、阳性对照组(人参水提液2.0 g·kg-1)、绣球菌水提物3个剂量组(150、300和600 mg·kg-1)，每组10只，分别灌胃给予相应药物，每天1次，连续15 d，给药容积均为20 mL·kg-1体重，对照组给予等容积蒸馏水，给药第11 d除正常对照组外均皮下按0.01 mL·g-1剂量注射环磷酰胺50 mg·kg-1，每天1次，连续4 d，末次给药后1 h尾静脉按0.01 mL·g-1剂量注射1∶4稀释的墨汁，注射2 min和10 min后于小鼠左右眶后静脉取血20 μL，置于预先盛有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的试管中混匀，取0.1 mL于96孔板在600 nm处测定吸光度(OD)；同时取小鼠胸腺、脾脏、肝脏称重，以每1 g小鼠的脾重和胸腺重作为脾指数和胸腺指数，并计算K值和吞噬指数。

1.3.2 对细胞免疫功能的影响

取雄性ICR小鼠5只，体重18～22 g，适应性喂养3 d后，脱颈椎处死，75%乙醇灭菌后无菌解剖，取脾脏装于含PBS的培养皿中，以5 mL注射塞碾磨后混匀，200目灭菌双层尼龙筛过滤。合并滤液，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，弹匀后加少量破红裂解液，以PBS中和破红，1 500 r·min-1离心5 min后弃上清，以含10% FBS的RPMI 1640培养液轻轻吹打重悬沉淀，采用流式进行活细胞计数。用于增殖实验测定。

增殖实验：调整小鼠脾细胞为1×107个·mL-1，每孔100 μL种板于96孔中。设立空白组、正常对照组、ConA组、绣球菌水提物各剂量组、绣球菌水提物各剂量联合ConA组，每孔加入药物100 μL，于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养44 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL继续培养4 h。2 000 r·min-1离心5 min，以移液枪小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育20 min，490 nm测定OD值，计算增殖指数。

1.4 统计方法

所有计量数据均表示为X±SD，采用SPSS软件进行单因素方差分析，计数数据采用q检验。

2 结果与分析

2.1 对非特异性免疫功能方面的影响

与正常组相比，环磷酰胺注射后小鼠体重下降，其中模型组具有统计学差异(表1)。与模型组相比，各给药组和阳性组吞噬指数升高，其中绣球菌水提物300和600 mg·kg-1处理组具有统计学差异。

表1 绣球菌水提物对小鼠碳廓清试验的影响

与正常组相比，模型组肝脏系数有增加，各组均无显著差异，但各组脾脏和胸腺系数极显著下降

(表2)。与模型组相比，绣球菌水提物300和600 mg·kg-1处理组和阳性组胸腺系数呈增加趋势，其中阳性组与模型组有显著差异。与模型组相比，绣球菌水提物各处理组和阳性组脾脏指数升高，其中绣球菌水提物300 mg·kg-1处理组和阳性组具有统计学差异，表明绣球菌水提物能够促进胸腺和脾细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能。

表2 绣球菌水提物对小鼠脏器指数的影响

2.2 对细胞免疫功能的影响

如表3所示，单独给药时，绣球菌水提物0.4和0.8 mg·mL-1具有促淋巴细胞增殖趋势，但无统计学差异，当浓度达到1.6和3.2 mg·mL-1时呈现抑制淋巴细胞增殖趋势，尤其浓度为3.2 mg·mL-1时具有统计学显著差异。ConA(5 μg·mL-1)单独处理组对小鼠淋巴细胞增殖有一定的促进作用，与正常组相比具有统计学差异。联合给药时，绣球菌水提物各剂量组刺激脾淋巴细胞增殖程度均较单独给药时有显著升高，尤其在0.4和0.8 mg·mL-1剂量下与ConA有协同促进作用，具有统计学意义，当浓度升高到1.6 mg·mL-1时，较ConA(5 μg·mL-1)单独处理组无明显差异，当浓度达3.2 mg·mL-1时，呈现抑制淋巴细胞增殖作用。本试验条件下，绣球菌水提物具有一定的免疫功能促进作用。

表3 绣球菌水提物对小鼠淋巴细胞体外增殖活性的影响

3 讨论

目前已经有多个关于绣球菌多糖在提高免疫力方面的报道，谢添等[8]的研究发现，绣球菌多糖能够促进巨噬细胞RAW264.7的增殖，具有潜在的免疫调节作用，这可能与其通过细胞表面受体TLR4激活信号转导通路，增强下游细胞因子的释放来调节巨噬细胞的免疫功能有关[9]。郝晨阳等[10]的研究发现，绣球菌多糖对免疫低下小鼠肠道免疫功能具有很好的调节作用。张迪等[11]也报道了绣球菌多糖具有促进大鼠脾淋巴细胞体外增殖的免疫活性。因此，在本研究中绣球菌水提物对环磷酰胺诱导小鼠免疫下降具有保护作用，可增强巨噬细胞的吞噬功能，同时对小鼠淋巴细胞增殖有一定的促进作用，这些免疫促进活性可能与水提物中的多糖有关。