农作物遗传育种中RAPD 技术的应用分析

黎永丹

（贵州医科大学神奇民族医药学院，贵州 贵阳 550004）

农作物育种是放大其基因优势，改良作物生长态势，保质增收，为我国农业现代化发展赋能的重要科研项目。随着我国“菜篮子”工程的持续推进，相关研究人员应合理应用RAPD 技术，充分发挥其在保护农作物遗传多样性、纯度鉴定以及标记育种中的优势，保证各类农作物品种与资源确定的便捷性和科学性，为农业生产提供更高质量的育种服务，更好地保证农作物持续供应，解决在农业生产中存在的育种问题。

1 RAPD 技术的原理与优劣势

1.1 原理

RAPD 本质上是一种全新并切实有效的遗传标记，其应用原理是通过对于一系列碱基序列存在不同的随机引物针对基因组DNA 展开PRC 扩增，然后利用凝胶电泳对扩增产物DNA 片段所具有的多态性进行分析，在其中存在的扩增片段分别表示基因组上的各个位点，其所展现出的多态性能充分展现出相应区域DNA 所具有的多态性。RADP 所使用的DAN 序列整体呈现出一定的差异性。在基因组DAN 上，不同的特定引物都包含着相应的结合位点，若基因组在上述区域产生DNA 片段插入或者是缺失等现象，便有可能会导致其特定结合位点的分布出现变化。在此过程中，扩增产物在大小及数量等方面均会随之出现变化。工作人员进行PRC 检测便能完成对基因组DNA 多态性的合理检测工作。对于单一引物来说，仅能实现对于基因组特定区域DNA 多态性的检测，通过一系列引物则能够使得检测区域逐渐实现对整个基因组的全方位覆盖。基于此，科学使用RAPD 技术能帮助工作人员全方位开展对于基因组DNA 的多态性检测工作，还能将其作为依据建立起相应的DNA 指纹图谱。

1.2 优劣势

其一，优势。引物自身不存在种属特异性，采用一套随机引物能有效应用在不同作物基因组的分析。同时，合理使用RAPD 构建基因图谱不会涉及克隆问题，其在实际应用过程中能展现出更加简便、快速的特点，并且分析工作还可以实现自动化，不会产生过于繁杂的程序，在应用时也不会产生过大的DNA 用量，对于一次反应来说仅需要10～50 ng 模板。

其二，劣势。RAPD 属于一种显性标记，无法有效区分纯合子以及杂合子，所以在试验过程中往往呈现出相对较差的重复性以及稳定性。除此以外，该技术还面临共迁徙问题，仅能够分开长度存在差异性的DNA 片段，但对长度相同但碱基序列各不相同的片段难以达到预期效果。工作人员在正式应用该技术时，需要在充分发挥出其应用优势的同时尽可能避免其劣势[1]。

2 RAPD 技术的改进

2.1 改进扩增程序

改进扩增程序是RAPD 分子标记方法改进的重要组成部分。模板DNA 处在94 ℃变性解链—36 ℃使得引物和模板退火—72 ℃扩增，还要经历至少45 圈的循环，通过应用相关物质实现对于产物的染色，并采用紫外光对其展开检测工作，该程序往往要花费4 h 以上，若处理样品较多，便需要扩大在PRC 扩增方面所投入的时间。

完成优化改进的扩增程序，94 ℃1 min 的变性时间缩短为10 s，经验证，这一时间长度能够基本上满足RAPD 反应中模板解链的需求。与此同时，短时间变性还可以获取更加具有丰富性以及清晰性的扩增电泳条带图谱。这主要是因为在94 ℃环境中，Taq 酶在一段时间之后依然能够保存一定的活性，但从实际情况来看，其生命活性的实际跨度始终存在局限性，当其反复经历较长时间的变性之后，最终势必会导致催化活性降低，所以缩短原有的变性时间能够在一定程度上强化其催化活性，可以为PCR 反应创造良好的条件[2]。

同时，工作人员还可以将复性时间维持在30 s 左右。相关研究结果显示，30 s 的退火温度能够充分同RAPD 反应过程中引物同模板之间的配对结合相适应，并且不会对最终的扩增效果造成负面影响。对于电泳条带图谱形式来说，扩增时间这一参数对于其影响较大，结合相关研究可知，其延伸在实践方面的长短同PCR 反应中的最大扩增判断大小之间存在一定的关系。若延伸时间能够维持在5～10 s，便呈线性关系。延伸时间为5 s 足够使其扩增0.6 kb 大小的片段，而当其时间延伸到60 s 之后便能够出现3 kb 的扩增片段。在充分考虑节省时间的基础上还应当确保其在EB 染色之后能够出现方便进行荧光亮度较高的条带，扩增时间随机确定，最终证明其效果良好。循环次数的多少对于扩增程度有一定影响，但经过试验证明，循环35 圈和45 圈相比，在最终的试验结果上并不存在突出的差异性。在完成改进工作之后的扩增程序之后，一次RAPD 反应的时间大概要经历2 h，所以能够节省2 h，从绝大部分引物扩增结果来看，可以在极大程度上提升电泳条带检出效果。

2.2 提高稳定性

为了有效提升试验过程中RAPD 技术应用的稳定性，相关工作人员需要加强对于模板的控制，要合理把控模板DNA 本身所具有的纯度。从目前的实际情况来看，PCR 技术本身作为一种重要的DNA 扩增方法，有相对较高的敏感性，一般来说，在常规PCR 反应中会将模板控制在102～105 拷贝的靶序列。

通常情况下，在1 ng 的大肠杆菌DNA 中的拷贝数总共包含3×105个靶分子，所以能够得出在模板中包含小量的外源污染，其对于最终RAPD 的试验结果有着较大的影响。因此，在正式开展试验的过程中需要保障所选用的DNA 抽提方法效率较高，能真正实现对模板纯度的合理控制，为RAPD 反应奠定坚实的基础。PCR 扩增仪器的使用同样会对试验最终结果造成一定影响，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行染色，能够在原有基础上促进RAPD 自身分辨率以及灵敏度的进一步提升，并且对于保障RAPD 技术应用的实效性以及稳定性有重要意义[3]。

3 RAPD 技术在农作物遗传育种中的应用——以番茄作物为例

3.1 鉴定品种纯度

现如今鉴定农作物种子纯度经常会应用RAPD 技术，应用该技术比传统的化学法以及形态学等具有一定的特殊性。一是植物组织不论处在哪一个发育时期，都能够对其进行分析。二是应用该技术不仅能明确各个品种之间遗传因子的差异，还可以充分展现出母体细胞质非孟德尔遗传因子影响。三是能够直接针对基因核苷酸组成展开相应的探测工作，无论其DNA 序列是否存在编码，都能利用探针展现，并且整体具有较高的准确性以及灵敏性。四是分离的DNA 样品需要在特定的时间范围内对其开展长时间的保存工作，此举能够为追溯性以及仲裁性鉴定等工作的开展提供支持。除此以外，相关工作人员可以结合现有条件制备大量DNA，为后续长期应用提供支持。针对普通番茄而言，其本身属于一种自花授粉植物，在实际杂交育种阶段常会出现母本自交的现象，进而出现假杂种的现象，这一现象是工作人员在控制种子纯度过程中需要着重解决的问题。应用RAPD 技术主要是建立RAPD 扩增产物图谱，然后再鉴定品种的纯度以及真实性，在实施阶段能有效减少在时间以及人力成本方面的过度消耗，并且不会产生过多的样品需求，能够在任何发育期都实现应用。相关研究人员在试验中选取了3 个番茄品种的F1 杂交种展开了相应的分析工作，对各个杂种的DNA 进行了RAPD 分析，在多个随机引物中合理筛选两个引物，以便于有效区分母本以及杂种一代，最终结果表明，可以在杂种鉴定方面使用RAPD 技术。

相关研究人员通过应用RAPD 技术，对普遍种植在我国东北地区的两个番茄杂种展开了纯度鉴定工作，从100 个引物当中寻找5 个引物进行纯度鉴定，应用该方法具有一定的简单性和适用性。部分人员在试验中采用番茄F1 代杂交品种的干种子作为材料，使用RAPD 技术初步实现对于种子自身纯度的鉴定。其所选用的RAPD 引物是在众多个随机引物中所筛选出的BA1072，在正式使用该方法的过程中不用开展田间种植便能够鉴定番茄杂种的纯度，并确保其具有较高的纯度。研究人员可以基于RAPD 技术实现对番茄体细胞无性系变异的有效鉴定，在未经筛选的叶片中提取DNA，然后构建起可以同番茄RAFD 分析相适应的PCR 条件，可以立足于多个随机引物，在其中寻找能够进行番茄品种体细胞无性系变异的引物。合理使用该方法对体细胞无性编译鉴定，能够切实提升其快速性以及简单性；同时，因为本身并不涉及较大的DNA 用量，所以不会对后续被检植株的正常生长造成影响，可极大程度地提升选择效率。

3.2 种质资源研究

番茄野生种具有良好的抗病虫能力，科学使用DNA 分子标记法合理进行番茄属种质资源研究，能够高效应用在品种资源保存以及鉴定等相关工作上。目前，多样化的分子标记方法已经实现了在品种纯度分析、番茄品种鉴定以及种植分析等多方面的广泛应用，具体包括SSR 标记、RFLP 标记及RAPD 标记等。

国外专家使用RAPD 技术对秘鲁和智利等多个番茄种展开了聚类分析工作，结果表明，PC 同EC 所具有的遗传背景存在相对较明显的差异，在EC 中的红果以及绿果划分基本上能够符合RFLP 标记的分析结果。不同材料的番茄也有不同的遗传背景，这一结果也符合现阶段的研究成果，RFLP 和RAPD 分类结果基本上同番茄形态学分类的有关研究成果相一致。我国研究人员针对番茄属的43 份材料展开了相应的RAPD分析工作，通过聚类分析能够使番茄本身划分成4 个类群。在综合分析基因杂合度以及遗传封堵等指数的基础上，能够明确相对于普通番茄类群野生类群有更为突出的遗传多样性，这也在一定程度上表明野生类群中富含着更加丰富且能够在番茄育种中实现高效应用的遗传资源[4]。

相关研究人员应用RAPD 技术对部分番茄品种展开了比较和研究工作，对各个品种之间所存在的遗传差异进行详细分析，合理采用41 个RAPD 引物对大量品种进行分析，最终得出了98 个多态性RAPD 标记。从实际情况来看，智利、秘鲁以及厄瓜多尔等地区的品种在差异性方面要远比其他来源的品种大，对于普通番茄来说，品种的差异性大多是受到所在地理区域不同的影响。研究人员通过观察种质库中的29 份番茄材料，明确了其中有19 对以上的变异，其对于不同的基因重组来说存在着较大的潜力，可以进一步展现出种植资源库本身具有保存遗传多样性的能力。

3.3 基因分子标记

当前，RAPD 技术多应用在番茄基因分子标记中，根据抗病基因以及性状基因进行标记工作，可有效对育种以及定位起到辅助作用。在番茄生长过程中，烟草花叶病毒是主要病原之一，经常开展抗TMV 基因标记工作，根据抗病基因的具体位置，可使重组率下降。在近等基因的组建下，包含Tm-2 产生的代群体，结合多个随机引物对Tm-2 基因标记进行挑选，大约19%的近等基因产生多态性，并取其中引物进行分析，发现69%的引物产生多态性与nv 基因分离现象。

在RAPD 技术的研究下，对抗TMV 基因座展开深入分析，并建立不同标记，形成完整的单拷贝序列。同时，在RAPD 技术的应用过程中，可有效获取与番茄抗TMV 基因的分子标记。在分离群体内运用相关分析方法可对番茄分子标记进行探究，由此可获得连锁分子标记，遗传距离为7.067 cm。在感病以及抗病的基因中随机挑选引物。其中，OPK-6 能够扩增出特异片段，将该片段进行再次组合能够形成PCR 引物。利用该引物可在两个品系中继续扩增，以形成相应片段，将小片段与RAPD 片段杂交，并对不同品系内的片段回收测序，可充分发现酶切位点，将片段切为不同片段，由此获取SCAR 标记，将此标记运用到群体分析中，确保分析结构与实际检测结果保持相同。

同时，利用抗病以及感病系列进行群体检验，标记番茄黄化卷叶病毒的QTL 基因，抗病中带有细叶抗番茄黄化卷叶病毒基因。在此系列中，挑选出抗性较强的以及感病最强的F4 系，将其合理组成基因池，对不同基因池以多个引物进行分析。其中，42%左右的引物可出现多态片段，出现该情况的主要原因是亲本遗传差距相对较大，其由不同野生番茄所掺杂。通过检验多态引物，可得出相应引物与抗病性保持联系，其他引物则呈现随机分布的状态。在对RAPD 标记分析下，充分表明其处于相同的连锁群体内，其在抗番茄黄化卷叶病毒中所占比例大约为27.7%。在普通番茄以及潘那利翻群体下，充分运用BSA 方法合理挑选随机引物，从而得到相应的多态RAPD 引物[5-6]。

4 结论

通过应用RAPD 技术可以更好地丰富、保存和改良农作物的遗传基因。在RAPD 技术的未来发展中，应进一步结合克隆技术、转基因技术等生物科学技术，为农作物育种提供更完善、科学、高效的育种服务，保证广大农民获得更多的经济效益，确保我国农业朝着智慧转和高质量方向发展。同时，应加深在农作物种质资源上的研究，发挥RAPD 技术的育种优势，以此保证我国的种质资源管理工作的规范化和科学化发展，提高种质分类的准确性以及效率水平。