造血祖细胞激酶1蛋白激酶在肿瘤中的研究进展

苗 雷，左 锐，季晓君，周秋华，马昌友，吴 舰，徐 丹

(南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京 210046)

造血祖细胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1)又称MAP4K1，是一种造血特异性蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶，是哺乳动物Ste20相关蛋白激酶MAP4K家族的成员。HPK1由1个N端激酶结构域和4个富含脯氨酸的基序组成，这些基序能够与含SH3结构域的蛋白质结合；在C末端也有1个Cirton同源结构域，可能作为调节域且可能参与大分子相互作用[1-2]；中央结构域还包含1个caspase-3切割位点。HPK1是一种免疫调节抑制激酶，主要在淋巴器官/组织中表达，包括骨髓、淋巴结、胸腺、脾脏、胎盘、胎肝；在造血室中，HPK1在所有类型的细胞中表达，如造血祖细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞[3-4]。作为免疫因子，HPK1在免疫反应中发挥重要作用，能够将MAPK家族中的MAP3K信号转导至MAP2K，引起c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的活化，JNK激酶与Th1/Th2分化、细胞增殖与凋亡等多种T细胞反应相关[5]。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、银屑病关节炎，患者外周血单核细胞和T细胞中的HPK1表达水平下调[6-7]，表明HPK1可能通过调控T细胞介导的免疫反应在自身免疫性疾病中发挥重要作用。本文将主要描述HPK1在多种肿瘤中的研究进展，如乳腺癌[8-9]、肺癌[10]、胰腺癌[11]、膀胱癌[12]、结肠癌[13]等。

1 HPK1信号通路

HPK1是T细胞受体(T cell receptor, TCR)的负调控因子[14]。当TCR激活后，HPK1被Gads和Grb2等衔接蛋白募集到TCR复合物，Lck/Zap70在Tyr381位点磷酸化HPK1，为SLP76(一个分子量76 ku，含有SH2结构域的白细胞磷蛋白)创造一个对接点[15]。HPK1的完全激活需要Ser171和Thr165位点的磷酸化，Ser171可通过PKD1的途径被磷酸化，而Thr165似乎是一个自磷酸化位点。完全激活的HPK1导致SLP76在Ser376残基位点被磷酸化，14-3-3蛋白(与磷酸丝氨酸/苏氨酸结合的第一信号分子)的募集[16]和TCR复合物的降解，从而抑制TCR信号传导。HPK1介导的T细胞信号的负调控也可通过前列腺素E2受体以PKA依赖的方式交替触发。

HPK1可与许多接头蛋白结合，如SLP76家族，Gads、HIP-55、GRB2家族，LAT、CRK家族等，活化造血干细胞的SAPK/JNK信号途径，从而对TCR通路进行负向调节。HPK1能负调控树突状细胞的活化和T细胞与B细胞反馈[6,17]；与TCR负反馈调控类似的机制，B细胞受体(B cell receptor, BCR)也将HPK1作为负反馈机制控制B细胞激活。在肿瘤中，TCR由于HPK1的激活而被抑制，从而造成了免疫逃逸，因此，抑制HPK1可增强T细胞活性，从而提高抗肿瘤免疫。

近期有学者研究发现，HPK1通过NF-κB-Blimp1信号轴来调控T细胞的功能[18]。RNA-Seq分析发现，在HPK1敲除的T细胞中，PRDM1(Blimp1基因编码的蛋白)和GATA3表达显著降低，TBX21表达增加。在B16-F10小鼠移植瘤模型中，PRDM1在HPK1敲除的T细胞中表达显著降低，而GATA3的表达水平则与野生型T细胞无明显差别。因此，HPK1是一种关键的TCR近端激酶，在T细胞活化时通过促进Blimp1的表达来调节肿瘤浸润性T细胞的功能障碍(例如T细胞衰竭，Th1细胞无力，激活诱导T细胞死亡等)，而HPK1基因敲除能促进小鼠T细胞的抗肿瘤反应，从而抑制肿瘤生长。

2 HPK1与肿瘤

HPK1会影响Fas介导的细胞凋亡，caspase-3介导HPK1在Asp385位点被切割，将HPK1从NF-κB的激活因子转变为NF-κB的抑制剂，从而有利于细胞的凋亡[1]。在不同癌症患者中，HPK1与多种T细胞衰竭信号(CD3E、TIGIT、PDCD1、CTLA4、HAVCR2及LAG3)呈正相关。同时，HPK1的表达水平与多种肿瘤患者的生存时间呈负相关，如脑低级别胶质瘤、肾透明细胞癌、胰腺癌以及浸润性乳腺癌等，HPK1低表达的患者具有更长的生存期[18]。此外，研究发现下调HPK1的转录可抑制人结肠癌细胞中的肿瘤进展[13]。

HPK1的过表达和敲除研究发现，HPK1负调控T细胞中MAP激酶信号通路和AP-1的转录[1]。多项研究表明，HPK1在减弱T细胞、B细胞和树突状细胞的免疫应答中发挥非冗余作用，使得HPK1成为一个有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点[2]。

2.1 HPK1与乳腺癌2020年，全球乳腺癌的新发病例数超过肺癌位列第一，占比达11.7%[19]。乳腺癌是全球癌症死亡的第5大原因之一，约占女性癌症病例的1/4和死亡病例的1/6。已证实乳腺癌与BRCA1、BRCA2、PTEN、p53等基因相关[20]，HPK1在乳腺癌中的研究亦有报道。

在乳腺癌中，HPK1的功能与其他肿瘤似乎存在差异，HPK1的过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。都闯等[8]通过检测102例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织(距癌边缘>5 cm)中p-Akt和HPK1的蛋白表达情况，发现乳腺癌组织中p-Akt和HPK1表达水平呈负相关。因此，p-Akt的高表达可提高癌细胞下游p16蛋白的表达，增强癌细胞的浸润和黏附能力；HPK1表达缺失则导致杀伤性T淋巴细胞活力不足，导致乳腺癌的进展。王磊等[9]通过对91例乳腺癌组织和85例乳腺腺瘤组织中Kif2a和HPK1的表达研究，发现乳腺癌组织中Kif2a表达量高于乳腺腺瘤组织，而HPK1表达量低于乳腺腺瘤组织；进一步相关性分析发现，乳腺癌组织中Kif2a表达量与多种癌基因(DEK、iASPP-SV、Stat3、MDM2、Fra-1)和耐药基因(ESR1、MDR1、P-gp、MRP1、GST-π)呈正相关，而HPK1表达量与上述癌基因和耐药基因呈负相关。因此认为乳腺癌组织中Kif2a基因的异常高表达和HPK1基因的异常低表达会影响癌基因和耐药基因的表达，影响乳腺癌的恶性进展。

研究表明[21]，HPK1在乳腺癌组织和细胞中均低表达，而HPK1过表达则可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞增殖和迁移，并诱导凋亡，可使MCF-7乳腺癌细胞周期阻断在G0/G1期。动物实验证实，HPK1过表达可抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长，提高其生存率。机制研究发现，HPK1过表达会引起JNK、p53、caspase-3、PTEN蛋白的表达上调，MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白的表达下调。

2.2 HPK1与肺癌肺癌是2020年全球第二大最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因，新发病例数占比达11.4%，死亡数达18.0%[19]。

非小细胞肺癌具有免疫原性差的特点，可能与肿瘤环境中存在前列腺素2(prostaglandin E 2,PGE2)等免疫抑制因子相关。PGE2被证实能激活HPK1，而在HPK1基因缺失的小鼠模型中，PGE2诱导的Lewis肺癌细胞的生长明显受到抑制。研究人员将3LL细胞静脉注射到野生型或HPK1-/-小鼠中，免疫组化发现HPK1-/-小鼠的肿瘤灶中存在CD3+淋巴细胞浸润，野生型小鼠肿瘤灶中未检测到，进一步发现CD4+和CD8+T细胞均有浸润；再将野生型或HPK1-/-的T细胞与3LL细胞一起转移到T细胞缺陷的RAG-/-宿主中，发现接受HPK1-/-T细胞的小鼠肺部肿瘤病灶数量和大小均显著减少。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)的存在以及T细胞转移到T细胞缺陷小鼠体内的实验结果表明肿瘤排斥反应是T细胞介导的。进一步分析表明可能是由于HPK1敲除的T细胞能够耐受PGE2介导的对T细胞增殖、IL-2产生和凋亡的抑制。因此得出结论，PGE2通过HPK1抑制T细胞介导的抗肿瘤反应[10]。

55 ku的HPK1相互作用蛋白(HPK1-interaction protein of 55 ku, HIP-55)，又称DBNL、SH3P7和mAbp1，是一种多域结合蛋白，对器官发育和免疫反应至关重要，能够调控心血管功能、免疫系统、神经元形态等[22]。HIP-55是适当的细胞生长控制所必需的，有研究显示，HIP-55在肺癌细胞系和肺癌患者的肿瘤组织中上调，增强HIP-55的表达可促进肺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，而沉默HIP-55可逆转这些效应。实验证明，14-3-3蛋白参与HIP-55对HPK1-JNK信号通路的调节。机制上，HIP-55调节肿瘤发生的机制可能是通过其与HPK1的相互作用，HIP-55介导的肿瘤发生活性似乎部分通过拮抗HPK1的功能介导。HIP-55与HPK1的相互作用可成为一种针对HIP-55介导的癌症的新策略，比如抑制HIP-55或破坏HIP-55与HPK1的相互作用[23]。

2.3 HPK1与胰腺癌胰腺癌恶性程度高，通常预后不良，5年生存率不足10%，被称为“癌中之王”，2020年全球新发病例占比为2.6%，死亡人数与新发病例数几乎一样，是男女癌症死亡的第7大原因[19]。

有研究表明，HPK1在胰腺癌组织中丢失，HPK1蛋白表达的缺失与胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)的进展和侵袭性胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas, PDA)的发展显著相关，可能有助于胰腺癌的肿瘤发生[24]。该研究同时表明，PDA中的HPK1蛋白表达缺失是通过蛋白酶体途径实现的，这需要HPK1激酶活性来降解。HPK1在胰腺癌中稳定p21和p27并导致细胞周期停滞，进一步证明HPK1可能在PDA中作为肿瘤抑制基因发挥作用。

Song等[11]研究发现，HPK1是一种肿瘤抑制因子，通过靶向Axl进行内吞转运和溶酶体降解下调AXL蛋白表达及其下游信号通路。HPK1优先通过其C端结构域与Axl相互作用，并导致Axl的下调，HPK1介导的Axl降解依赖于HPK1激酶活性。此外，还发现HPK1增加了Axl与原癌基因c-Cbl的结合，促进Axl泛素化并加速Axl内化，通过内体运输到溶酶体进行降解。在人类PanIN病变中，Axl蛋白表达与HPK1表达呈负相关，HPK1的低表达和AXL的高表达与胰腺导管腺癌患者的低生存率显著相关。

一项使用HPK1-M46转基因小鼠的研究表明，HPK1的免疫抑制功能需要HPK1激酶活性，激酶结构域的失活增强了抗肿瘤免疫反应和抗PD-L1功效。说明使用选择性小分子抑制剂结合免疫检查点抑制剂治疗，靶向免疫细胞中的HPK1激酶活性可能是有效癌症治疗的替代策略[2]。然而，HPK1激酶活性是胰腺癌中HPK1介导的致癌酪氨酸受体AXL降解及其下游信号通路抑制所必需的，因此，HPK1在肿瘤细胞中与肿瘤微环境中免疫细胞的相互作用和激活中的作用还有待研究[11]。

2.4 HPK1与膀胱癌膀胱癌是全球第10大常见的癌症，2020年大约有57.3万新发病例，占所有癌症新发病例数的3.0%，约21.3万人死亡。男性中更为常见，发病率和死亡率约为全球女性的4倍，是男性第6大常见癌症和第9大癌症死亡原因[19]。

Hsa-miR-96位于人类7号染色体上，长度22nt。Hsa-miR-96的靶基因，包括IRS1和HPK1。Wang等[12]研究发现，在膀胱尿路上皮癌中，hsa-miR-96的表达水平高于正常组织，且无性别差异。hsa-miR-96的下调显著影响膀胱癌T24细胞的表型，抑制细胞的增殖与迁移并促进细胞的凋亡。与对照相比，hsa-miR-96的下调会导致T24细胞中IRS1和HPK1的mRNA水平和蛋白水平显著降低，MAP2K2的表达无差异，表明hsa-miR-96可能通过上调IRS1和HPK1水平来影响膀胱癌T24细胞的生长。

2.5 HPK1与其他肿瘤据报道，HPK1还与其他几种肿瘤相关。HPK1高拷贝数与接受奥沙利铂为基础化疗的III期结直肠癌患者的复发和生存一致相关，强调HPK1在调节奥沙利铂反应中的重要作用及其作为以奥沙利铂为基础的化疗疗效的生物标志物的潜力[25]。

HPK1在高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)诱导的抗性AML细胞系中高度表达。HPK1在AML细胞中的过表达诱导了AML细胞对HHT的抵抗。HPK1的过度表达是预测AML预后不良的独立风险因素。体外研究显示，HPK1通过MAPK和DNA损伤/修复途径调控细胞周期，揭示HPK1是开发AML治疗方法的一个潜在目标[26]。

3 靶向HPK1的药物研发现状

肿瘤免疫逃逸有两种机制[27]，其一是肿瘤细胞下调其抗原加工/递呈机制，如主要组织相容性复合体(MHC)I、蛋白酶体亚基潜伏膜蛋白(LMP)2和LMP7、抗原加工相关的转运蛋白(TAP)和tapasin，以阻止被T细胞识别，造成肿瘤免疫逃逸；另一机制是肿瘤细胞向肿瘤微环境分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-8、IL-10、VEGF、ROS等，抑制T细胞功能和/或树突细胞的成熟，导致肿瘤抗原向T细胞交叉递呈缺陷。

肿瘤细胞通过促进其PD-L1和B7-1/2分别与T细胞上的免疫检查点蛋白PD-1和CTLA-4结合，或者增加PD-L1和PD-1的表达，均可导致T细胞衰竭[28]。HPK1诱导肿瘤浸润性T细胞障碍，减弱T细胞、B细胞和树突状细胞的免疫应答，是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点，且可与PD1/PD-L1联用。但截至目前，尚无HPK1相关药物上市，进展较快的在研药物处于临床Ⅰ或Ⅰ/Ⅱ期，均为肿瘤免疫治疗。

2021年3月，百济神州宣布其开发的高活性、高选择性HPK1小分子抑制剂BGB-15025 的Ⅰ期临床试验(NCT04649385)，已完成首例患者给药。该临床试验采取BGB-15025单用和与PD-1单克隆抗体替雷利珠单抗联用，治疗晚期实体瘤患者。根据开发公司公布的临床前数据，BGB-15025可增加PMBC中IL-2的产生；CT26WT同源模型中联用PD-1抗体，低至1 mg·kg-1也可表现出显著的联用效果：68%的肿瘤体积小于100 mm3，28%达到无瘤状态；初步毒理研究还表明BGB-15025治疗窗较宽，约20～50倍。

2020年9月，由Treadwell Therapeutics公司开发的新型、口服强效HPK1激酶抑制剂CFI-420411的Ⅰ/Ⅱ期临床研究(NCT04521413)，将进行首次患者给药，拟采取单用或联合帕博利珠单抗在实体瘤患者中的疗效。专利中(WO2016205942)示例性化合物A1对HPK1的IC50小于0.05 μmol·L-1。CT26结肠癌细胞系异种移植模型研究显示，每日给药一次剂量为75 mg·kg-1和150 mg·kg-1g的A1分别使肿瘤生长抑制44%和64%，21 d存活率分别为25%和37.5%；抗PD-1抗体单用TGI为34%，21 d存活率为12.5%，与150 mg·kg-1的A1联用可使TGI增至86%，21 d存活率提高至87.5%，显示出良好的体内抗肿瘤活性。以上两种药物的临床前实验数据均提示，HPK1抑制剂与抗PD-1抗体联用可能是一个较好的方案。

西安宇繁的XYF-19 CAR-T细胞，正在开展在复发或难治性CD19+血液系统恶性肿瘤的安全性研究，利用慢病毒载体向T细胞插入CD19特异性嵌合抗原受体，用CRISPR基因编辑消除内源性HPK1，目前也处于Ⅰ期临床(NCT04037566)。开发人员的研究报道，HPK1敲除的CD19 CRA-T细胞能降低瘤内T细胞衰竭标志物PD-1、TIM-3和LAG-3表达水平，促进细胞因子IL-13、IL-2的分泌，从而提高抗肿瘤作用[18]。

此外，还有一些对HPK1有较好抑制活性的化合物被报道。GNE-1858是一种ATP竞争性抑制剂，能够以剂量依赖性方式抑制HPK激酶结构域的所有3种变异。在SLP76磷酸化实验中，对野生型HPK1和活性模拟突变体HPK1-TSEE的抑制作用相同，IC50均为1.9 nmol·L-1，对HPK1-SA的残余激酶活性的IC50为4.5 nmol·L-1[14]。选择性小分子抑制剂CompK，能够显著改善人类T细胞的功能，增强TCR识别病毒和肿瘤相关抗原的能力以及CD8+T细胞对肿瘤的溶解活性，与抗PD-1有显著协同作用；动物研究显示，CompK联合PD-1抗体治疗表现出免疫应答的提高和极好的抗肿瘤疗效；该研究还发现HPK1激酶的抑制可通过调节人类树突状细胞及其相关网络来促进抗肿瘤免疫[29]。

4 小结

相较于传统的手术、放疗和常规化疗，寻找合适的靶点来实现抗肿瘤免疫治疗成为具有前景的手段之一。HPK1作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，负调控TCR/BCR信号以及树突状细胞介导的免疫反应，已被证实与多种癌症的发生、进展相关联，是一个适合肿瘤治疗干预的靶点。但在不同癌症中，HPK1所发挥的作用似乎有所差别，如在乳腺癌、胰腺癌中，其可能发挥抑癌作用，而在已开展临床试验的药物中，除XYF-19 CAR-T细胞治疗明确表示适应症为血液瘤外，另两项针对实体瘤的适应症尚不知晓，因此，在开发靶向HPK1药物过程中需注意筛选相应的肿瘤适应症。

MAP4K家族中除HPK1(MAP4K1)外，还有MAP4K2、MAP4K3、MAP4K4、MAP4K5和MAP4K6五个成员。其中，MAP4K3又称为GLK激酶，它和HPK1都与SLP-76结合，但在TCR信号通路中作用相反[30]：SLP-76介导GLK激酶的激活，活化的GLK与PKCθ相互作用并激活PKCθ，导致T细胞活化；而HPK1磷酸化SLP-76的Ser-376，诱导激活的SLP-76的蛋白酶体降解，导致TCR信号的衰减。因此，在药物开发中要注意筛选出对GLK激酶具有选择性的HPK1抑制剂。