组织工程在先天性心脏瓣膜病外科治疗领域中的应用

窦铮综述，李守军审校

先天性心脏病（先心病）种类复杂，病种繁多，其外科治疗往往离不开瓣膜、补片、外管道等人工材料的植入，其中以瓣膜病为甚。随着医疗技术的进步，外科人工植入物也经历了一代代更迭，但或多或少都存在缺陷，即使目前临床上更受青睐的生物瓣，也面临瓣膜退化，耐久性差等问题，使其在临床应用过程中受到一定限制[1]。对儿科患者而言，最大的问题莫过于儿童的生长发育导致的心内结构变化，导致人工瓣膜-患者不匹配，并可能引起术后患儿心功能减低、心室重构等严重并发症[2]。上世纪80 年代，美国Joseph Vacanti 和Robert Langer提出了尝试人工制造人类器官以应对器官移植物短缺的设想，并最终发展成为今天的组织工程学（TE）[3-4]。目前人类对组织工程的设想，是在解决现有移植物面临的抗凝、衰败、炎症反应等问题的基础上，使组织工程移植物植入人体后具有一定的生长发育潜能。尽管这一设想在临床阶段尚未完全实现，但组织工程在动物实验中得到的积极成果及其在儿科领域的发展潜力，依旧吸引着众多科研工作者投入其中。本文收集了目前组织工程在先心病瓣膜外科领域的临床应用成功实例，并进行汇总，以期对组织工程在先心病领域的研究提供指导，并为小儿心脏外科医师提供一定的临床参考。

1 组织工程技术简介

根据细胞定植发生部位的不同，组织工程可以分为：体外组织工程、体内组织工程和原位组织工程。

1.1 体外组织工程

体外组织工程也是最早提出的组织工程范例。简单来说是将一部分体外培养的种子细胞，植入预先处理好的可吸收细胞支架，辅以细胞因子等，在体外生物反应器模拟的生理条件下进行增殖（细胞化）后植入人体[5]。在人体中，细胞支架逐渐被分解吸收，当植入细胞的增殖速度＞细胞支架的分解速度时，移植物便表现出稳定的自我生长趋势。在支架中原有基质与细胞因子的共同作用下，种子细胞会逐步增殖为新的具有相应形态和功能的目标组织、器官，从而达到治疗目的。但体外组织工程所需前期试验较为复杂，如何选取合适的细胞与材料一直困扰着科研人员。

目前具有临床意义的组织工程瓣膜主要聚焦于对可吸收细胞支架的研究。组织工程发展过程中，支架材料经历了从同种和异种供体瓣膜到天然聚合物、合成生物可降解聚合物和杂化支架等技术进展[6]。脱细胞技术是生物来源组织工程细胞支架的基础，即用酶、洗涤剂等除去组织中的细胞，保留细胞外基质及其几何结构，形成具有细胞空隙的三维支架。但同种异体瓣来源不稳定，异种瓣膜在儿科中的免疫原性问题尚未解决[3]。新一代可生物降解的合成材料/天然聚合物材料可用于替代脱细胞生物瓣膜，如聚乙二醇、聚己内酯等，然而聚合物支架生物强度和耐久性虽好，其降解产物所引起的局部炎症反应依旧限制了其临床应用[7]。当下，新型的3D 打印支架逐渐进入人们的视野，该技术通常选取生物-聚合物水凝胶作为支架材料，种子细胞附着于3D支架上，可进行生长、增殖。2017 年，Bracaglia 等[8]报道了一种由聚乙二醇二丙烯酸酯与脱细胞牛心包基质匀浆交联的水凝胶制成的生物-聚合物杂化支架，并证实了二者交联可以提高杂化支架的压缩模量，机械强度良好，在组织工程尤其是儿科领域移植物的开发中具有重要潜力。

1.2 体内组织工程

体内组织工程也称活体组织工程，是将不可吸收的模具植入人体非病变部位（一般为皮下），利用人体自身的炎症反应，使纤维组织包裹模具，一段时间后取出，剔除模具，回收纤维组织用于移植物制备。相较于其他两种方法，体内组织工程不需要复杂的实验室步骤以及漫长的制备时间，取材相对不受伦理学限制，但由于制备过程全程位于体内，可控性相对较差，且如何诱导形成心内组织，尤其是瓣膜的复杂多层结构，成为了限制其应用的最大因素[9]。

1.3 原位组织工程

将脱细胞的细胞支架直接植入患者体内（通常是待修补的部位），利用患者自身的循环系统充当生物反应器。原位组织工程的流程简单、成本较低，相较于传统体外生物反应器，再细胞化发生在患者体内，于生理条件下的血氧饱和度、血压和剪切力等条件下进行，有利于组织的生长、增殖。然而，原位组织工程相应的难度也更大，血栓并发症常见。且如何在体内控制支架的再细胞化是该技术最大的挑战[7]。目前有研究人员尝试用静电纺丝制作原位组织工程瓣膜微孔支架，并在羊肺动脉瓣植入的12个月随访中获得了较为理想的结果[10]，在儿科组织工程瓣膜应用方向表现出优秀的潜力，但仍缺乏相应的临床数据支持。

2 不同移植物的临床应用进展

2.1 组织工程瓣膜

目前临床常用的瓣膜植入物主要为机械瓣和生物瓣，机械瓣耐用性强，但需终生抗凝；生物瓣虽不需长期服用抗凝药物，但由于瓣膜衰败较快，常在10～15 年内需二次手术或介入换瓣[11]。目前常用于降低生物瓣膜免疫原性的戊二醛已被证实其残留物具有一定的细胞毒性，并会引起强烈的宿主免疫反应，加速瓣膜衰败[12]。自脱细胞技术开发以来，各种脱细胞瓣膜应运而生，在一定程度上弥补了现有瓣膜植入物的缺陷。

脱细胞同种瓣膜在临床实践过程中表现出巨大潜力。一项多中心研究回顾了共计287 例右心室流出道狭窄患者，其中163 例患者接受降低了免疫原性的脱细胞同种异体组织工程瓣膜移植，124 例患者接受了目前标准的同种异体生物瓣置换治疗。两组患者死亡率、精算生存期无差别，组织工程组的右心室流出道功能恢复情况明显优于标准组。另外，研究者对1 岁以下患者进行了亚组分析，发现与标准组相比，组织工程组患儿的免于再干预率更高，但差异未达到统计学意义，而免于功能障碍率显著高于标准组，差异具有统计学意义[13]。德国汉诺威医学院的Tudorache 等[14]报告了64 例接受脱细胞同种主动脉瓣置换的儿童及青少年患者的平均2 年随访结果，所有患者术中及术后组织学分析均未发现移植物出现钙化，再细胞化良好，未观察到炎症反应。对10 岁以下患儿进行的亚组分析也印证了以上结果。另外，为进一步证实同种瓣膜的优势，该团队中的Sarikouch 等[15]又为364 例患者进行了组织工程同种瓣移植并完成了所有同种异体移植物的术后组织学评估，该试验共有8 例患者需要术后再移植，同种主动脉瓣和肺动脉瓣的免于再移植率分别为96.1%和98.7%，感染和瓣下狭窄是引起再移植的主要原因。研究者发现，发生感染性心内膜炎患者的再细胞化水平明显低于未感染者，且使用人造材料会增加发生感染性心内膜炎的风险，故并不建议将人造材料与组织工程瓣膜联合使用。更有趣的是，在所有接受移植的患者中，组织学检查评分最优者是一名婴儿，据报道，患儿在6 周大时即接受了组织工程主动脉瓣置换术，术后患儿的移植物与间充质细胞、平滑肌细胞等具有良好的整体再细胞化率，且几乎未发现免疫细胞，4.5 年后患儿的无冠窦再细胞化依旧良好。

对主动脉瓣置换患者，目前临床常采用ROSS手术用于替代现有人工机械瓣和生物瓣，但ROSS术后仍面临肺动脉瓣假体置换以及二次手术无法取材等问题[5]。最初对原位组织工程瓣膜的尝试就是将脱细胞猪瓣膜移置入Ross 术后患儿的肺动脉瓣位，然而术后4 例瓣膜均表现出非常严重的炎症反应和钙化，这可能由脱细胞不完全引起[16]。经过不断的技术革新，目前脱细胞同种异体组织工程瓣膜已经成功地应用于Ross 手术，能够维持良好的瓣膜功能和免于再手术率，但在临床推广之前，仍应考虑如何解决瓣叶增厚的问题[7]。

作为脱细胞异种和同种基质的替代品，可生物降解的合成和天然聚合物已被引入临床。聚合物材料没有异种疾病和排斥反应的风险，并且来源广泛，易于批量制备。纤维蛋白等天然聚合物，分解产物没有毒性，不会引起炎症反应；合成聚合物，如聚乙醇酸等，具有足够的强度和耐久性，其分解产物可能会引起局部炎症。聚乙醇酸聚合物支架在先心病血管移植领域已经取得了良好的临床结果，期待该材料在瓣膜病领域的突破。

此外，间充质细胞可能适用于体外方法设计儿科组织工程瓣膜。该细胞可在出生前或出生后立即获取，用于合成自体瓣膜组织，以便对患儿及早进行手术换瓣。真皮成纤维细胞是目前更新的一类种子细胞，但目前缺乏足够的临床应用实例以证明其可行性。

2.2 组织工程补片和外管道

先天性心脏瓣膜病，常合并多种缺损、畸形，往往需要同时应用人工瓣膜、补片、带瓣管道等进行修补，故对组织工程补片和外管道的临床应用进展也进行简要回顾和综述。

传统异种材料补片不具有生长潜能，同样会导致严重的钙化形成，故目前以自体心包为首选材料，但其缺乏生长潜力，且需二次手术时，往往因炎症、粘连等导致自体心包不可取用[17-18]。2018 年，莱顿大学医学中心首次报道了一类新型脱细胞牛心包补片CardioCel 的临床应用结果[19]。同年Pavy 等[20]回顾了101 例18 岁以下应用CardioCel 治疗先心病的患儿。该材料被应用于63 例间隔缺损修补（房间隔缺损3 例、室间隔缺损54 例、完全型房室间隔缺损4 例、部分型房室间隔缺损2 例），24 例血管扩大（升主动脉4 例、主动脉弓部5 例、肺动脉15 例），16例右心室流出道扩大（漏斗部扩大补片11 例、跨环补片5 例），10 例瓣膜重建（主动脉瓣延长或单瓣修复术4 例、Ozaki 手术2 例、二尖瓣成形术3 例、三尖瓣成形术1 例）以及1 例静脉吻合（Senning 手术1例）。结果显示，术后30 d 内患儿死亡率3.9%，中位随访212 d 期间，共有5 例患者因补片衰败而进行再手术修补。研究者发现，CardioCel 在术中易于植入，在右心系统低压区的表现良好，然而左心系统高压区域中早期即发生移植物衰败，研究者认为这是由于在正常血压下，主动脉和CardioCel 补片的弹性出现不匹配，血液对主动脉壁产生剪切力，从而引起内膜反应产生局部组织肥厚，进而导致严重的主动脉狭窄。Deutsch 等[21]的研究也在低龄患儿中印证了这一点，研究者对CardioCel 修补后脱落的患者的补片进行了组织形态学分析，发现在5 例＜18的患者中，1 例7 岁主动脉瓣修补的患者补片仅在体内存留的3 d；1 例1 岁行二尖瓣修补的患者，9 d后因补片脱落再次手术修补；1 例部分房室间隔缺损修补术的5 岁患儿补片在其体内存留了237 d。然而在年长儿中（10 岁、16 岁），左心系统补片分别存留了795 d 和1 247 d。5 例脱落补片的组织形态学分析几乎全部发现肉芽组织层，2 例年长儿补片中均存在胶原基质的轻微碎裂。

2017 年，Bockeria 等[22]首次在5 例单心室病变的儿科患者中植入脱细胞生物可吸收移植物，作为下腔静脉和肺动脉之间的心外腔肺导管。Sugiura 等[23]对25 例平均年龄5.5 岁的生理学单心室患儿进行了组织工程血管移植，移植物采用聚乙醇酸支架植入自体骨髓单核细胞种植。经过平均11.1 年的随访，所有患儿未发生移植物相关死亡，也没有证据表明有动脉瘤形成、移植物破裂、感染和钙化等情况的发生。证实了该材料在小儿心血管手术中具有可行性。

另外值得关注的是，2020 年，Fujita 等[18]首次报道了将体内组织工程血管移植物代替自体心包应用于肺动脉重建手术中的尝试，研究者首先将硅胶引流管制成了组织工程血管模具，在患儿初次手术时植入腹部皮下。其中一例为1 岁男孩，首次手术行姑息性右室流出道疏通，同时植入模具，13 个月后取出并裁剪组织用于肺动脉狭窄的修补；另一例4 岁男孩在初次肺动脉置换术后26 个月，将组织工程移植物用于肺动脉残余狭窄的修补。其中，该1岁患儿术后五年状况良好，40 个月CT 未发现狭窄或动脉瘤的形成。初步证实了体内组织工程用作肺动脉狭窄修补的可行性。次年，该团队补充了体内组织工程血管移植物在先心病中的应用实例[24]，研究者对共计4 例患有主肺侧支动脉或合并室间隔缺损的肺动脉闭锁的患儿施行了体内移植。经过最长4 年的随访，所有患者肺动静脉压均有不同程度缓解，且并未出现肺动脉再狭窄或瘤样扩张，故作者认为对于需要多次分期手术的先心病患儿，体内组织工程血管移植物是一种非常有前景的自体心包替代品。

3 讨论与总结

对于组织工程瓣膜移植物的研究，还处于临床前的基础研究或动物实验阶段。然而不同物种间的免疫系统具有较大差距，在动物实验中获得阳性结果，并不能说明能较易转化为临床。目前获得良好临床反馈的组织工程瓣膜，主要集中在不同材质细胞支架的移植物，其他方向尚未取得突破。初步结果良好的补片和外管道移植物也缺乏更大样本量数据的支持。目前组织工程在儿科领域的发展，还有非常漫长的路要走，但同样我们也可以看到许多材料均表现出令人振奋的潜力，希望未来有更多临床应用的成功实例以及更新组织工程材料的出现，能推动该领域的发展，为先心病患儿带来新希望。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突