结核分枝杆菌贝达喹啉和氯法齐明耐药及其交叉耐药机制研究进展

王晓英，罗 明，张汇征, 易利华

结核病是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染病，是由单一致病菌引起的死亡人数最多的疾病[1]。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)估算，2019年耐多药结核病(Multi-drug Resistant Tuberculosis, MDR-TB)及利福平耐药结核病(Rifampicin Resistant Tuberculosis, RR-TB)患者数为46.5万。2019年，我国约有6.5万MDR/RR-TB患者，占全球MDR/RR-TB病例的14%，仅次于印度(27%)。然而，RR-/MDR-TB的治疗非常困难，成功率仅为57%[2]。2019年，WHO在耐药结核病治疗整合指南中，将贝达喹啉和氯法齐明分别列为MDR-TB治疗的A组及B组药物[3]。2020年，WHO进一步修改了广泛耐药结核病(Extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的定义，即符合MDR/RR-TB的定义，同时对氟喹诺酮类以及至少一种其他的A组药物耐药[4]。虽然贝达喹啉和氯法齐明在我国尚未作为抗结核药物进行大规模的使用，但已存在对贝达喹啉和氯法齐明耐药的MTB菌株。本文将系统阐述贝达喹啉和氯法齐明的作用机理以及耐药相关基因突变等情况，为2种药物耐药快速检测工具的开发提供依据。

1 贝达喹啉和氯法齐明的作用机理

1.1 贝达喹啉的作用机理 相比于其他抗结核药物，贝达喹啉的作用机制独特、抗MTB活性强、疗效好，是近50年来第一个上市的抗结核新药[5-6]。贝达喹啉是一种二芳基喹啉类化合物，通过与MTB的ATP合成酶低聚物亚基C相结合，影响ATP合成酶质子泵的活性，导致ATP合成受阻。最终通过阻止MTB中的ATP能量供应而发挥抑菌和杀菌的作用[7-8]。

1.2 氯法齐明的作用机理 目前，氯法齐明抗MTB的作用机制研究还不是很清楚，多数研究认为其作用机理主要有以下3个方面：1)MTB呼吸过程中需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)产生的电子。氯法齐明通过与重组Ⅱ型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶底物甲基萘醌竞争NADH贡献的电子而变为还原型氯法齐明，随后被氧化形成超氧化物，最终通过释放活性氧而实现治疗结核病的作用[9-12]；2)氯法齐明可能通过溶血磷脂介导的膜功能障碍而抑制K+的吸收，从而通过干扰MTB膜电位而导致ATP含量的下降，发挥抗MTB功效[9,11,13]；3)氯法齐明可通过改变MTB衍生因子的抑制作用而增强吞噬细胞的内杀伤能力，即增强吞噬细胞对MTB的吞噬能力，而且氯法齐明的半衰期较长、药代动力学较好[14-15]。

2 贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的相关机制

贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药情况的出现主要和Rv0678(mmpR)基因和Rv2535c(pepQ)基因的突变有关。

2.1Rv0678基因(mmpR)Rv0678基因属于MarR调控基因之一，其编码产物为调控蛋白。Rv0678基因具有多种生物学效应，如对抗菌药物的耐药性，毒力因子的调控以及对氧化应激的敏感性等[16]。Rv0678基因编码的调控蛋白被认为是MmpS2/MmpL2，MmpS4/MmpL4和MmpS5/MmpL5转运体系统的抑制因子[16]。MmpS/MmpL蛋白被认为是MTB细胞壁脂类、毒性因子以及一些药物的转运体。MmpS5/MmpL5尤其参与了贝达喹啉、氯法齐明以及唑类药物(如益康唑等)的外排[17]。Rv0678突变导致了MmpS5/MmpL5抑制因子的灭活，上调了外排泵系统MmpS5/MmpL5的表达，增加了贝达喹啉和氯法齐明的外排，从而导致细胞内药物浓度下降，出现MTB对贝达喹啉和氯法齐明耐药的现象[10,18]。

2.1.1Rv0678突变与贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的相关性 Pang等[19]的研究显示，在未使用过贝达喹啉和氯法齐明的Pre-XDR-TB和XDR-TB患者中，以最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)>1 μg/mL为氯法齐明耐药的判断标准，有5株XDR-TB对氯法齐明耐药，其中4株发现了Rv0678突变(Ser53Pro(2株)，Ser53Leu(1株)，Tyr157Asp(1株))。同时，Rv0678突变(Ser53Pro(2株))也与贝达喹啉耐药相关。此研究表明贝达喹啉和氯法齐明的交叉耐药是由Rv0678基因第53位密码子突变导致的(Ser53Pro)[19]。对于复治的Pre-XDR-TB和XDR-TB患者，以MIC≥1.2 μg/mL为氯法齐明耐药的判断标准，5株耐氯法齐明MTB菌株中有4株同时对贝达喹啉耐药，而且均存在Rv0678突变,突变位点以及导致的氨基酸改变分别为：T437C(M146T)，G5T(S2I)，C158T (S53L)以及T350G (L117R)[20]。这种因Rv0678突变导致的贝达喹啉和氯法齐明原发性耐药可能是使用了其他抗结核药物进行治疗的结果。而且Villellas等的研究发现，相比于对抗结核药物敏感的MTB患者，Rv0678的突变频率在MDR-TB患者中更高[21]。He等对未使用贝达喹啉的TB患者菌株进行研究，结果表明，在6株耐贝达喹啉的MTB菌株中有4株同时对氯法齐明耐药。全基因组测试结果显示，这4株交叉耐药菌株均存在Rv0678突变(Ser63Arg，Ser68Gly以及在核苷酸192位置的G碱基插入突变)[22]。Zheng等的研究发现在339株MTB菌株中，有2株为贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药菌株，且该交叉耐药是由Rv0678突变引起，由此导致的氨基酸改变为Gln31Arg和Ser53Pr[23]。

另外，研究表明MTB对贝达喹啉和氯法齐明存在获得性耐药的情况。2014年，Somoskovi等报道了1例MDR-TB患者对贝达喹啉和氯法齐明产生了获得性耐药[24]。这例耐药菌株(贝达喹啉：MIC=3.2 μg/mL；氯法齐明：MIC≥4 μg/mL)出现了Rv0678突变(GTG-GCG, 导致了M1A置换)[25]。随后，Liu等研究也报道了MTB对贝达喹啉和氯法齐明产生获得性耐药的情况，在采用含贝达喹啉的治疗方案后，1.8%(5/277)的MDR-TB患者出现了对2种药物的交叉耐药，且均为Rv0678突变[26]。在南非，贝达喹啉和氯法齐明已经被普遍应用在TB患者的治疗中。Nimmo等研究发现，南非也存在对贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的MTB菌株，而且主要是由Rv0678突变引起的，并导致了23个不同的氨基酸改变[27]。Rv0678突变将导致外排泵系统MmpS5/MmpL5表达上调，细胞内药物浓度降低，导致贝达喹啉的MIC增加了2～8倍，同时也使氯法齐明的MIC增加了2～4倍[10,28]。

2.1.2Rv0678突变与氯法齐明耐药的相关性Rv0678突变是导致MTB对氯法齐明耐药的主要机制。2015年，Zhang等研究表明，97%(93/96)的耐氯法齐明MTB菌株存在Rv0678突变，其中2个突变热点分别为G193(突变频率为43.8%，42/96)和C466T(突变频率为11.5%，11/96)[29]。Islam的研究也表明，在存在Rv0678突变的MTB菌株中，以G193和C466T突变最为常见[9]。Pang等研究表明，5.6%(5/90)的XDR-TB菌株对氯法齐明耐药，且该耐药均是由Rv0678突变导致的[19]。由此可见，Rv0678突变是导致MTB对氯法齐明耐药的主要原因，同时也是导致MTB对贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的重要机制。

2.2Rv2535c基因(pepQ)Rv2535c基因编码的372位氨基酸蛋白有2个结构域：即100-aa N-末端α/β结构域和250-aa C-末端肽酶结构域，其编码产物可能为细胞质肽酶，但目前其具体的作用机制还不是很清楚。Almeida等研究发现，Rv2535c突变导致贝达喹啉和氯法齐明的MIC增加了4倍，并伴随着贝达喹啉和氯法齐明药效的降低，但并没有导致MTB对这2种药物完全耐药[30]。Rv2535c突变导致的贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药表现在：14位密码子(Ala)中插入C 碱基导致的移码突变以及催化结构域271位密码子(Arg)中C碱基删除导致的移码突变。同时该研究表明，因Rv2535c突变导致的贝达喹啉和氯法齐明低水平交叉耐药并没有涉及MmpS5/MmpL5表达的上调，可能与通过其他机制增加药物的外排有关(如抑制MmpL5的降解等)[30]。而在Pang[19]以及Xu等[20]研究中，并未检测到贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药菌株中存在Rv2535c突变。Zhang等的研究表明，在96株耐氯法齐明MTB菌株中，有1株(1%)存在Rv2535c突变，突变位点为G265T[29]。由此可见，因Rv2535c突变导致的氯法齐明耐药较少见。因此，Rv2535c突变在耐氯法齐明MTB菌株中的作用以及突变频率仍需进一步的研究。

3 贝达喹啉耐药的其它机制

除了因Rv0678和Rv2535c突变导致的贝达喹啉和氯法齐明低浓度交叉耐药外，atpE突变(靶点突变)也是导致MTB对贝达喹啉耐药的原因之一。atpE基因编码ATP合成酶的跨膜蛋白，而此跨膜蛋白是贝达喹啉的作用靶点。atpE突变将导致贝达喹啉与亚基C的结合力减弱，从而维持了H+转移和ATP的产生，导致MTB对贝达喹啉耐药。2005年，Andries等第一次发现atpE突变(氨基酸改变为Ala63Pro)导致了MTB对贝达喹啉耐药[31]。随后，Petrella等在耐贝达喹啉MTB菌株中发现了atpE新的突变位点(I66M)[32]。atpE靶基因突变导致的贝达喹啉耐药，可使贝达喹啉的MIC增加8～133倍[33-34]。2010年， Huitric等一项研究表明约有30%(15/53)的耐贝达喹啉MTB菌株存在atpE突变,5个点突变分别为A28V、A63P、I66M、A28P以及G61A[33]。而在Pang等[19]以及Xu等[20]研究中，未检测到耐贝达喹啉MTB菌株中存在atpE突变，可能与测试菌株的数量和来源有关。因此，atpE突变在贝达喹啉耐药中的作用仍需进行更深入的研究。

4 氯法齐明耐药的其它机制

2018年，Ismail等研究表明，耐贝达喹啉的MTB菌株很可能全部对氯法齐明耐药，然而耐氯法齐明MTB菌株中仅1/3表现出对贝达喹啉的交叉耐药[35]，此研究表明，MTB对氯法齐明的耐药还存在着其他的耐药机制，如Rv1979c突变。

Rv1979c基因可能编码参与氨基酸转运的通透酶。Rv1979c突变导致氯法齐明耐药的机制目前还不是很清楚。2015年，Zhang等第一次在耐氯法齐明MTB菌株中发现了Rv1979c突变，并推测其可能与氨基酸转运有关。Rv1979c基因有可能通过直接或间接的方式影响氯法齐明的转运和吸收，从而改变MTB的生理功能，进而导致MTB对氯法齐明的敏感性降低[29]。该研究发现，在耐氯法齐明的MTB菌株(96株)中，有3株存在Rv1979c突变：其中一株仅有Rv1979c突变(突变位点：T1052C；氨基酸改变：V351A)；其余2株同时存在Rv0678c和Rv1979c突变。与仅有Rv1979c突变的MTB菌株相比，同时存在Rv0678c和Rv1979c突变的MTB菌株氯法齐明的MIC升高(1 mg/L)，因此在存在其他基因突变的基础上附加的Rv1979c突变可能导致高水平氯法齐明耐药[29]。在Xu等研究中，以MIC≥1.2μg/mL为氯法齐明耐药的判断标准，在1株氯法齐明耐药菌株(1/5,20%)中检测到了Rv1979c突变，突变位点为A155C，导致的氨基酸改变为V52G[20]。而在Ismail等研究中，并未检测到耐氯法齐明MTB菌株中存在Rv1979c突变[36]。Phelan等研究还表明，Rv1979c基因突变与异烟肼耐药相关[37]。因此，Rv1979c突变在耐氯法齐明MTB菌株中的作用还需进行更深入的研究。

5 展 望

综上所述，目前已知的导致贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药的基因突变均为非靶点基因突变，包括Rv0678(mmpR)基因和Rv2535c(pepQ)基因，其中Rv0678(mmpR)突变频率较高，是导致MTB对贝达喹啉和氯法齐明交叉耐药以及MTB对氯法齐明耐药的重要原因。虽然贝达喹啉和氯法齐明存在低浓度交叉耐药的情况，但已有研究表明，增加贝达喹啉用量同时联合氯法齐明具有更好的抗结核效果[26]。目前贝达喹啉和氯法齐明耐药性及其耐药机制仍有许多未阐明之处，还需进行更深入的研究，为今后两种药物的合理应用提供参考。

利益冲突：无

引用本文格式：王晓英，罗明，张汇征，等. 结核分枝杆菌贝达喹啉和氯法齐明耐药及其交叉耐药机制研究进展[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(2)：165-169. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.031