丝裂原活化蛋白激酶信号通路在类风湿性关节炎发病中的作用研究进展

马雪雯，张 晗，李 霖，邓雁如，房士明，

（天津中医药大学1.方剂学教育部重点实验室，2.天津市现代中药重点实验室，天津 301617）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，累及人体多处关节，表现为对称性关节肿胀、疼痛、畸形甚至残疾，严重时可能引发肺炎、泌尿系统感染和心脏疾病等并发症。据统计，1980-2019年，全球RA的年患病率为0.46%，造成严重的社会经济负担[1]。RA发病主要由遗传、自身免疫和环境等因素共同作用，绝经后妇女发生率显著高于同龄男性[2]。RA的病理学特征为炎症细胞浸润引发的持续性滑膜组织炎症和增生，异常增生的滑膜组织逐渐对软骨组织进行侵袭造成软骨组织侵蚀和损伤[3]。

RA发病期间，巨噬细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞大量进入滑膜组织，并分泌白细胞介素（interleukin，IL）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和转化生长因子 β1等促炎因子。促炎因子作用于成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）造成FLS异常活化，并刺激其分泌大量干扰素、集落刺激因子、生长因子和趋化因子，进而使FLS进一步活化并过度增殖。FLS过度增殖后向关节组织侵袭，加剧RA关节滑膜炎症和基质损伤[4]。FLS异常激活后高表达的整合素是介导FLS向软骨组织侵袭的重要分子。整合素通过与软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的胶原蛋白和层粘连蛋白等结合，促进FLS增殖并向软骨组织迁移和侵袭。异常活化的FLS诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）过度表达，水解ECM加重关节损伤[5-6]。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是真核细胞内一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与调控细胞的有丝分裂、分化、增殖和凋亡以及炎症反应等过程。哺乳动物MAPK家族主要存在3条经典途径：P38途径、c-Jun N端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）途径和细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）途径。MAPK信号通路的基本组成模式是三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAPK kinase kinase，MAPKKK），MAPK激酶（MAPK kinase，MAPKK）和MAPK，不同途径可由不同生长因子和细胞因子结合相应受体依次活化细胞内 MAPKKK，MAPKK和 MAPK。不同的MAPK蛋白激活不同的转录因子完成各自的信号转导[7]。研究发现，P38 蛋白有 4 个亚型 P38α，P38β，P38γ和P38δ；JNK蛋白有3个亚型JNK1，JNK2和JNK3；ERK蛋白有3个亚型ERK1，ERK2和ERK5。MAPK信号通路的各亚型通路间不仅能够独立完成信号转导，还可以通过复杂的机制联系发挥协同或拮抗作用。

MAPK信号通路与RA的发生发展密切相关。近年来研究者从药理学、免疫学和遗传学等角度开展了大量研究，探索以MAPK信号通路为靶点治疗RA的可能性[8]。Liu等[9]总结了MAPK，NF-κB和磷脂酰肌醇3激酶/Akt激酶等信号通路分别在RA发病机制中的作用。Dudics等[10]综述了当前临床治疗药物和天然产物治疗RA不同的作用机制，并总结了不同药物在治疗过程中的特点。本文综述MAPK信号通路在RA发病中的作用研究进展，对RA靶向治疗具有重要意义。

1 MAPK信号通路活化促进FLS增殖和迁移

持续性的滑膜炎症是RA发病过程中的主要特征，异常激活的MAPK蛋白导致滑膜细胞产生异常增殖和侵袭是造成滑膜炎的重要原因之一。滑膜细胞主要有滑膜巨噬细胞和FLS 2种。正常状态下，FLS可分泌滑液为组织提供营养；RA发病状态下，MAPK信号通路被细胞因子激活，造成FLS增殖并刺激FLS分泌促炎因子，其后FLS向关节软骨侵袭，从而形成滑膜炎症，加重滑膜组织增生和软骨组织损伤[11]。

1.1 促进FLS增殖

RA滑膜内巨噬细胞和粒细胞分泌的TNF-α和IL-1等炎症因子可激活MAPK通路中一条或多条亚型通路，导致FLS增殖。罗素等[12]采用TNF-α 10 μg·L-1诱导P38和ERK蛋白磷酸化进而活化FLS，大黄素（emodin）可浓度依赖性地抑制ERK1，ERK2和P38的核移位及蛋白表达，从而抑制ERK1/2和P38信号通路活化，抑制FLS增殖，有效控制RA滑膜炎进程。Li等[13]研究MAPK信号通路间的“cross talk”，采用JNK抑制剂SP600125抑制JNK蛋白时，P38和ERK蛋白表达同时被抑制；且当P38，JNK和ERK蛋白被抑制后，抑炎因子IL-4和转化生长因子β1表达升高及促炎因子干扰素γ和IL-17表达降低，FLS增殖水平下调，滑膜增生和炎症细胞浸润明显减轻。

音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信号通路与MAPK信号通路在共同促进细胞的异常增殖中存在密切联系。研究表明，SHH信号通路依赖G蛋白偶联受体 smoothened（SMO）参与 FLS 增殖[14]。MAPK信号通路作为细胞信号下游传递者接受SHH通路信号传递，共同促进FLS增殖。Zhu等[15]报道，SMO激动剂（SMO agonist，SAG）处理FLS后，JNK蛋白表达显著升高；SMO抑制剂环巴胺（cyclopamine）处理后，JNK蛋白表达显著降低；而JNK抑制剂SP600125对SAG刺激的FLS中JNK蛋白高表达具有抑制作用。提示SHH信号通路与JNK信号通路间存在信号传递。FLS经SAG处理后增殖、迁移和侵袭加重，而经SP600125处理后FLS增殖、迁移和侵袭减弱，表明JNK蛋白是SHH信号通路介导FLS增殖和迁移的下游分子。上述研究结果表明，SHH信号通路中的SMO蛋白在FLS活化中发挥重要作用，可能是防治RA的潜在靶点。

RA发展过程中脂质代谢紊乱持续存在，脂质分子与受体蛋白结合后可直接激活Ras同源基因家族（Ras homolog gene family，Rho）成员，进而激活MAPK信号通路造成FLS过度增殖，加速RA发展并增加心血管疾病的风险。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一种常见的小分子脂质，LPA与LPA受体1（LPA receptor 1，LPAR1）结合可依次激活Ras蛋白和Raf蛋白，进而激活MAPK信号通路，促进FLS增殖[16]。Wang等[17]报道，与健康者相比，RA患者血浆中LPA和LPAR1均显著增高，且滑膜组织中FLS过度增殖。RA患者FLS经小檗碱（berberine）干预后，K-Ras和C-Raf表达下调，P38和ERK蛋白磷酸化水平下降，表明小檗碱可阻断LPA介导的P38和ERK信号通路，抑制FLS增殖。

近年来越来越多的研究表明，异常表达的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）能够激活MAPK等多条信号通路调控炎症反应，参与自身免疫性疾病的发展[18]。Chen等[19]报道，IncRNA核旁斑点组装转录本1（lncRNA nuclear paraspeckle assembly transcript 1，lncRNA NEAT1）在 RA 滑膜中较正常滑膜表达显著升高，而miR-129和miR-204表达显著下降，且RA滑膜中ERK蛋白磷酸化程度明显升高，FLS增殖水平升高。当沉默lncRNA NEAT1后，ERK蛋白活化受到抑制，miR-129和miR-204表达上调，FLS增殖水平降低。上述结果表明，lncRNA NEAT1可激活ERK信号通路并抑制miR-129和miR-204表达，进而加剧FLS增殖。

1.2 促进FLS迁移

FLS不仅具有肿瘤细胞的过度增殖性，还具有侵袭性，其分泌的整合素作为细胞表面黏附受体介导其与软骨ECM黏附。FLS附着在软骨表面，对软骨基质进行侵袭并降解[20]。

FLS与整合素结合后通过加速其细胞骨架的F肌动蛋白重组向软骨组织发生迁移，其中肌动蛋白应激纤维是F肌动蛋白的重要组成部分，RA中FLS的增殖能够造成肌动蛋白应激纤维形成并加速细胞转移。Yang等[21]采用雷公藤甲素（triptolide）对FLS进行干预，发现雷公藤甲素可特异性抑制JNK蛋白活化，继而下调肌动蛋白应激纤维的表达，抑制F肌动蛋白聚合而降低FLS的侵袭能力，同时抑制FLS中MMP-9的分泌，从而减轻软骨基质破坏。

研究表明，MAPK信号通路和Akt信号通路在FLS迁移过程中共同发挥作用。Du等[22]采用3，3′-二吲哚基甲烷（3，3′-diindolylmethane，DIM）干预TNF-α诱导的FLS，发现P38和JNK蛋白磷酸化水平明显降低，FLS的迁移和侵袭减轻。虽然在TNF-α诱导的FLS中Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）磷酸化水平未明显增加，但DIM干预后明显被抑制，表明DIM可通过抑制Akt/mTOR通路抑制FLS迁移。综上所述，DIM能够抑制MAPK和Akt/mTOR信号通路以抑制FLS侵袭和迁移。

2 MAPK信号通路活化促进软骨组织破坏

关节软骨基质破坏主要由MAPK信号通路介导的MMP过度分泌所致ECM过度水解以及软骨细胞凋亡引起。MMP是一类依赖离子的含锌内肽酶家族，能够水解ECM中胶原蛋白、弹性蛋白及蛋白聚糖等主要成分[23]。软骨细胞是关节软骨中唯一细胞成分且增殖能力有限，其大量凋亡后关节软骨内无单核细胞对残留物进行分解，残留物堆积对基质中其他成分造成损伤[24]。

2.1 促进FLS和软骨细胞MMP合成

MMP通常以酶原的形式存在于ECM中，可在表皮生长因子、转化生长因子以及IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和巨噬细胞集落刺激因子等作用下由FLS和软骨细胞等合成分泌[25-26]。

MMP-1属于胶原降解酶，可水解ECM中Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型胶原，是参与RA软骨降解中的重要蛋白酶[27]。刘国钰等[28]报道，TNF-α诱导的FLS中MMP-1表达水平和JNK蛋白磷酸化水平显著升高；采用抗风湿药羟氯喹干预后，MMP-1和JNK蛋白表达水平显著降低，表明羟氯喹可通过抑制JNK信号通路的活化抑制FLS合成MMP-1，减轻关节内ECM损伤。

活化转录因子2（activating transcription factor 2，ATF2）因其亚细胞定位不同，可发挥转录增强或转录抑制的作用。活化的P38蛋白可激活ATF2参与滑膜炎发展。脂多糖诱导的FLS中P38蛋白磷酸化水平显著升高，活化的P38蛋白移位入核与下游转录因子ATF2结合形成转录因子AP-1，AP-1显著上调IL-1β和MMP-3表达。P38蛋白抑制剂SB203580特异性阻断P38蛋白的表达后，IL-1β和MMP-3mRNA表达均明显下调，炎症反应明显减轻[29]。

卵泡抑素样蛋白1（follistatin-like protein 1，FSTL1）是一种ECM糖蛋白，广泛表达于各种器官，参与多种生物学过程。近年来研究发现，FSTL1可作为一种新型的炎症因子参与炎症反应。Su等[30]报道，FSTL1作用于Toll样受体4，激活NF-κB，MAPK和JAK/STAT3信号通路，诱导MMP-1，MMP-3和MMP-13的表达，造成ECM的胶原纤维过度水解。因此，FSTL1也可作为研究RA的相关靶点之一。

2.2 促进软骨细胞凋亡

软骨细胞凋亡是造成RA关节软骨损伤的重要原因之一。一氧化氮（nitric oxide，NO）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等是引起软骨细胞凋亡的主要炎性介质[31]。TNF-α等促炎因子通过激活MAPK信号通路诱导上述炎性介质产生，激活胱天蛋白酶（caspase）和Fas/Fas-L等凋亡蛋白，造成软骨细胞凋亡。

2.2.1 促进软骨细胞合成NO

内源性NO一般由L-精氨酸经诱导型NO合酶（inducible NO synthase，iNOS）催化生成。炎症因子可诱导软骨细胞高表达iNOS催化产生NO。NO诱导线粒体损伤和胱天蛋白酶活化，促进凋亡小体形成，诱导软骨细胞凋亡。

纤连蛋白是正常软骨基质中重要成分，当其被水解为具有活性的纤连蛋白片段时可参与诱导软骨细胞凋亡[32-33]。Yasuda 等[34]报道，纤连蛋白片段激活P38信号通路上调iNOS表达，导致NO含量升高。采用透明质酸对其进行干预，发现透明质酸通过与CD44和细胞间黏附分子1结合抑制P38信号通路活化，从而抑制iNOS合成，导致NO生成减少，抑制软骨细胞凋亡。

2.2.2 促进软骨细胞合成ROS

ROS是有氧代谢的副产物，具有细胞毒性，主要包括超氧阴离子自由基、羟基自由基（OH·）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）非离子自由基等[35]。ROS在细胞中蓄积过多引起内质网应激，继而激活MAPK等信号通路介导胱天蛋白酶通路活化，诱导细胞凋亡[36]。

RA关节软骨中的ROS水平升高是关节部位加重损伤的主要原因。ROS可通过激活MAPK信号通路加剧促炎因子分泌，导致关节损伤。Huang等[37]报道，软骨细胞经地塞米松处理后，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4，NOX4）、P38蛋白表达水平和ROS水平均明显升高。采用NOX抑制剂乙酰香兰酮（apocynin）和P38抑制剂SB203580进行抑制，发现P38蛋白、胱天蛋白酶3和NOX4蛋白表达及ROS水平下降。由此表明，乙酰香兰酮和SB203580可抑制P38信号通路的磷酸化，下调胱天蛋白酶表达，抑制由NOX4导致的ROS水平升高，抑制软骨细胞凋亡。

2.2.3 促进软骨细胞表达酸敏离子通道

RA患者关节滑液在一定程度下呈现酸中毒现象，H+聚集可激活酸敏离子通道（acid-sensing ion channels，ASIC），参与RA发病过程中的软骨细胞凋亡。ASIC又称H+非电压门控阳离子通道，是由3个相同或不同的亚基构成三聚体形式的离子通道。目前已发现ASIC存在6个亚基，分别是ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3 和 ASIC4[38]。当细胞外pH下降时，ASIC1a，ASIC2a和ASIC3蛋白异常活化。ASIC1a和ASIC3激活Ca2+产生内流，激活MAPK等信号通路并进一步激活胱天蛋白酶等凋亡基因，参与细胞凋亡信号转导[39-40]。而ASIC2a可抑制Ca2+内流从而发挥抗细胞凋亡的作用[41]。

Zhou等[42]报道，ASIC1a特异性抑制剂狼蛛毒素和ASIC3特异性抑制剂海葵毒素共同作用于ASIC2a过表达的软骨细胞模型时，能够最大程度地增加对软骨细胞的保护作用。过表达的ASIC2a通道蛋白可抑制P38和ERK1/2蛋白的磷酸化，一方面上调Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达，下调Bax蛋白表达，减少软骨细胞凋亡；另一方面降低Ca2+水平亦抑制软骨细胞凋亡。上述两方面的作用可增强ASIC2a通道蛋白对软骨细胞的保护作用。

3 结语

RA作为一种慢性且难以治愈的自身免疫性疾病一直受到广泛关注。RA发病时会损害人体骨关节，严重时还会继发肺、心脏等器官损伤。从目前相关的研究结果来看，防治RA的途径主要包括抗FLS增殖、抗炎症细胞浸润、抗新血管和血管翳生成等。目前MAPK信号通路作为调节真核细胞增殖分化的重要途径在防治RA方面已有深入研究，发现活化的MAPK蛋白通过激活下游转录因子，一方面促进滑膜细胞增生和软骨细胞凋亡，另一方面导致滑膜细胞和软骨细胞中多种MMP高表达而过度水解ECM，最终造成关节损伤。然而MAPK信号通路的调节机制十分复杂，还可与Akt和NF-κB等其他信号通路协同作用。因此，还需深入研究RA中多种信号通路间的交互调节机制，以利于特异高效防治RA新药的开发。