奶牛场结核病常用检测技术的比较与应用

郝振江，杨秀娟，张晓利，田光，崔大江，邢春伟

（1.河北省唐山市汉沽管理区动物疫病预防控制中心，唐山 301501；2.河北省唐山市动物疫病预防控制中心，唐山 063000）

奶牛结核病是一种人畜共患的慢性消耗性传染病，严重威胁乳制品质量安全和人体健康，OIE将其列为B类疫病，我国将其列为二类动物传染病。结核分枝杆菌能在巨噬细胞内存活，属于胞内菌，因此淘汰感染牛群是消除结核病最有效的措施[1]。临床上有可见病变的牛占感染牛的少数，如有临床症状，差异也较大，经常无特异性症状出现[1]。因此对牛结核病的诊断主要靠检测的方法发现感染牛。多年来，该病一直是我国奶牛场必须检测净化的传染病，对其实施严格的检疫、净化等控制措施，也取得了明显成效。但是随着我国奶牛养殖业的快速发展，规模化、集约化已经成为奶牛养殖业的主要形式，养殖规模不断加大。随之而来的牛场结核病检测及净化工作压力也逐步加大，按照常规的PPD颈部皮内变态反应试验一年两次的检测方式已经不能完全适应现代化奶牛场结核病检测的需要，因此需要探索建立一套科学高效的结核病检测程序加以解决。

本文仅就当前几种常用的结核病检测技术进行比较分析与探讨，以期建立起一套适合于我国规模化奶牛场结核病检测的科学有效的程序，提高结核病检测的质量和效率，从而加快推进全国规模化奶牛场净化工作。

1 结核病检测方法

目前结核病常用检测方法主要有结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验和实验室γ-干扰素（INF-γ）ELISA检测技术。按照注射部位不同，PPD皮内变态反应试验又分为PPD颈部皮内变态反应试验（Sin-gle Intradermal Cervical Tuberculin,SICT）和PPD尾根腹面皮内变态反应试验（Caudal Fold Test,CFT），SICT被OIE确定为牛结核病法定检疫方法，被世界各国接受和采用[2]，也是我国结核病检测的法定方法，是目前国内基层结核病检测普遍采用的主要方法。CFT是OIE推荐的皮内变态反应试验中的一种，澳大利亚等国家采用CFT进行牛结核病筛查工作[3]，近年来国内基层也在逐步摸索推广验证使用。INF-γ试验作为OIE推荐的结核病检测方法之一[4]，是近几年来开发的一种针对结核病检测的快速检测方法，美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等国家均利用其辅助诊断牛结核病[5,6]，但限于检测成本昂贵，在我国仍未大范围普及推广应用。

2 三种结核病检测方法的敏感性、特异性、假阳性率、符合率比较

SICT和CFT主要是用提纯的PPD进行牛皮内接种，在72h后观察有无热、痛、肿胀等反应，对可疑牛需60d后再次复检。该方法检出率和准确率都比较高。目前PPD结核菌素试验的敏感性为85%，特异性为98%[1]。但是作为皮肤试验最大的缺点就是容易出现假阳性和假阴性反应。而IFN-γ试验主要是通过检测牛感染牛结核分枝杆菌后，机体通过细胞免疫产生的高水平IFN-γ含量的多少，来反映机体是否感染结核病[7]，是将试验牛血样的淋巴细胞加入特异性PPD一起孵育16～24h，由于致敏的淋巴细胞能够释放出INF-γ，因此可用于INF-γ-ELISA进行定量测定[8]。国外大量临床研究表明，该检测方法具有较高的敏感性和特异性，可以降低假阳性率，可以检测结核病早期感染[9]。其优点是敏感性高、特异性高，可以区分牛分枝杆菌和副结核或禽分枝杆菌感染，而且重复性好，易于标准化。

宋之波[10]等利用上述三种方法对大型奶牛场牛群结核病进行了分组检测对比试验。结果表明，在群体阴性牛比例、阳性牛比例、可疑牛比例指标上，SICT测定结果与CFT测定结果差异不显著（P＞0.05）；均可反映群体结核病感染率。SICT测定结果与INF-γ试验结果差异不显著（P＞0.05）；在阳性牛头数、可疑牛头数指标上INF-γ试验测定结果与SICT检测结果差异不显著，但是检测敏感性要高于SICT。王曲直[11]等也对皮内变态反应试验和IFN-γ试验进行了比较研究，发现SICT和CFT在试验牛中阳性检出率一致性高。国内一些研究者在结核污染牛群进行IFN-γ试验和皮内变态反应的比对，阳性符合率很高[12,13]。笔者也曾经于2017-2019年期间对用IFN-γ试验检测出的38头结核病阳性牛开展了SICT和CFT比较检测，SICT检测阳性牛为35头，CFT检测阳性牛36头，阳性符合率分别为92.11%和94.74%。这也证明了三种检测方法的阳性牛符合率较高。

3 三种检测方法操作特点及检测效能比较

3.1 SICT检测

SICT试验优点是对操作人员专业水平要求较低，一般经过简单培训就能操作[14]，所需设备简单，检疫费用较低。缺点是因牛只保定、剪毛、量皮厚、消毒、注射等操作步骤较多且繁琐，费时费力，且因在奶牛躯体前部进行检测操作，需有专人对牛头部进行固定，对奶牛刺激很大，容易造成较大应激反应而严重影响奶牛生产性能，严重时甚至可造成机械损伤或孕畜流产。所以实际检测中应用本方法检测工作效能较低。同时结果判定过程中容易出现非特异性反应，且人为因素影响较大，重复性较差。

3.2 CFT检测

CFT试验相对于SICT试验，因减少了剪毛、测原始皮厚等步骤，操作起来更为简单容易、方便。牛只保定只需颈枷即可，且在生产中由于奶牛已经比较适应直肠检查、输精、挤奶等操作刺激，因此本方法从牛只后面操作也对牛只应激较小。尾根腹面无毛更便于观察注射后的皮肤变态反应，结果判定时阴性通过肉眼观察或者触诊即可判定，可疑或阳性只需测量尾中褶厚度或者测量两侧尾褶厚度进行比较即可，受人为因素影响相对较小。这大大提高了结核病检测工作的效率和质量。据了解这种结核病检测技术已在国内某些大型牧场中常规应用。

3.3 INF-γ检测

其优点是操作相对简单、敏感性高，可以区分牛结核分枝杆菌和副结核分枝杆菌或禽分枝杆菌感染，而且重复性好，易于标准化；缺点是采血后必须在8h内进行检测[15]，试剂盒价格昂贵，成本高，需在实验室内才能完成最终检测。

4 讨论与分析

根据以上对三种牛结核病检测技术的比较，可以看出，三种检测技术均适用于我国规模化奶牛场的检测工作。但鉴于三种方法的自身特点，在实际应用上应灵活机动使用。皮内变态反应PPD主要用于规模牛群的结核病普检，从而发现阳性牛群体，为后续相应处置措施提供初步数据。阳性牛个体确诊应平行使用皮内变态反应试验、INF-γ试验、病原菌分离培养等方法。

CFT试验相较于SICT试验，因其操作相对容易，检测效率较高，更适合于大型规模化奶牛场用于对整体牛群的结核病普检工作，适宜在全国规模化奶牛场的结核病检测中普及推广，从而提升奶牛场的结核病检测工作效率和检测质量。因此建议将其也纳入到牛结核病检测的国家法定方法之中，以便于基层灵活选择使用。

SICT试验比较适应于中小型奶牛场或者大型规模化奶牛场对检出的可疑阳性牛进行复检复核，也可应用于基层兽医技术部门对规模奶牛场的结核病的抽样检测。

INF-γ试验，虽敏感性较高仅需抗凝血就可以进行检测，适合于实验室诊断和结核病早期诊断。但鉴于目前价格较高，限制了其大规模应用，当前主要用于对可疑阳性牛的复核确诊或者用于职能部门少量抽样检测。将来随着商品化检测试剂盒价格下降，该检测方法有望在临床结核病检测中得到普及和推广。

5 结论

鉴于以上总结分析，为了更好地开展奶牛结核病检测净化工作，应采取企业全面自检和职能部门抽检相结合的方式加以推进。企业自检可以根据需要自行组织开展或者委托有资质的第三方检测机构开展结核病检测工作，检测方法用PPD皮内变态反应试验，并有详细的检测记录存档备查。为此建议奶牛场自检或者委托检测结核病的检测程序可以这样实施：首先采用CFT试验进行普检注射，72h后进行普检结果判定；发现可疑或者阳性牛只60d后对其进行SICT试验进行复检注射，复检结果仍为可疑或者阳性的，则判定为阳性牛并严格按照规范进行处置，企业自检应每年2次。兽医主管部门抽检：每年进行1～2次奶牛结核病抽检，其工作程序为：审查企业结核病自检档案了解奶牛结核病感染情况，并根据结核病感染情况按照牛群存栏10%～20%的抽检比例（注意抽检采样要覆盖所有年龄段的牛群，以确保抽检的覆盖面和代表性）进行监督抽检，抽检可以采用PPD皮内变态试验，也可以采用INF-γ试验检测。经过上述方式连续检测2～3年，并严格实施阳性牛扑杀无害化处理，待群体奶牛结核病阳性率低于0.1%后，确定为结核病净化群。以后转为结核病净化维持检测阶段，企业每年自行普检1～2次，职能部门按照5%～10%的抽检比例每年抽检1～2次。

诚然，奶牛牛结核病检测技术不仅限于笔者以上所述三种方法，其他细菌学、血清学和分子生物学等新型检测方法也不断出现。因篇幅所限，本文仅就笔者所在地区常用的这三种方法进行了论述。总之，在奶牛结核病检测检疫的实践中，应借鉴国内外结核病检测的先进经验，不断摸索奶牛结核病检测的新方法和新技术，逐步建立起一套适合中国国情的奶牛结核病检测净化新模式，并在全国范围内得到推广应用，保障我国乳业健康发展。