动物布鲁氏菌病血清学检测方法的比较

杨 康，杨夷平，古丽巴哈·哈德尔，阿达来提·尤素甫，段进刚，何 波，方先珍*

（1.哈密市动物疫病预防控制中心，新疆 哈密 839000；2.伊州区动物疫病预防控制中心，新疆 哈密 839000）

布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，对人和动物的生殖、神经和骨骼系统可以造成严重损害，在我国属于二类动物疫病。 动物主要感染牛、羊、猪、狗，近几年来在牛羊中流行呈现增长趋势，严重威胁公共卫生安全和畜牧业健康发展[1～3]。 因此，如何能快速、准确的对该病进行实验室检测，对做好该病的动物疫病预防工作至关重要。目前，市场上流通的布病血清学检测试剂盒种类较多，各有优缺点：虎红平板凝集试验操作简单，但试验结果受反应温度和时间的影响，不易判定，大多数下用于样品的初筛；试管凝集试验是我国诊断布鲁氏菌病的金标准，但该方法操作起来繁琐、复杂、费时，不易现场操作；荧光偏振试验操作简单、反应时间短，准确率高，是OIE 贸易规定的试验方法，但该方法使用的诊断仪器和诊断试剂费用比较高；ELISA 试验操作简便、快速、样品需求量小，但该方法对实验条件和设备要求比较高，不便在基层使用[4～6]。如何能结合实际情况，筛选出检测速度快、准确性高、价格适宜、能指导生产的检测试剂盒值得我们去探讨与研究。 本文针对虎红平板凝集试验、试管凝集试验、荧光偏振试验、竞争酶联免疫吸附试验、间接酶联免疫吸附试验5 种常规血清学检测方法进行了比较分析，为今后开展布鲁氏菌病诊断技术提供了一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

收集哈密市域内近几年陆续送检的未经免疫的阳性血清151 份，阴性血清21 份，总计172 份。

1.1.2 检测试剂

布鲁氏菌菌病虎红抗原；试管凝集抗原、阴性血清、阳性血清；ELISA 检测试剂盒；荧光偏振检测诊断试剂盒。

1.1.3 主要仪器

酶标仪；洗板机；恒温培养箱；荧光偏振仪。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

RBT、SAT 试验按照GB／T 18646-2018 动物布鲁氏菌病诊断技术操作及结果判定；FPA 和ELISA 试验按照检测试剂盒的说明书进行操作及结果判定。

1.2.2 评价方法

在进行不同的试验方法比较时，利用Excel 将检测结果进行统计，并形成表1，对检测结果进行比较。并参照该表计算出：敏感性=（A／P1）×100%、特异性=（D／N1）×100%、假阳性率=（B／N1）×100%、假阴性率=（C／P1）×100%、一致性（符合率）=[（A＋D）／S]）×100%，用这些指标比较不同诊断试剂的诊断效果[7]。

表1 诊断试验与参比试验结果比对表

2 结果与分析

2.1 检测结果的比较

将收集的 172 份样品，用 RBT、SAT、FPA、cELISA、iELISA 进行检测，并以国标 GB／T 18646-2018 中的SAT 检测方法为参照，将各检测方法的检测结果录入到Excel 表格中，对数据进行整理得到表2。

表2 SAT 检测结果与FPA、cELISA、iELISA 检测结果的比较

续上表

2.2 不同诊断方法的效果评价

根据公式，计算出各诊断方法的一致性、敏感性与特异性，其中RBT 的敏感性最高，为100%；FPA 的特异性最高，为74.51%；FPA 的假阳性率最低，为25.49%，RBT 的假阴性率最低，为0；各诊断试验的符合率由高到低依次为RBT、FPA、cELISA、iELISA，具体结果见表3。

表3 不同诊断方法的效果评价

2.3 SAT 与FPA 检测灵敏度的比较

将购自于哈药集团生物疫苗有限公司的标准阳性血清按照表5 中的比例进行倍比稀释，SAT 最高在血清稀释度1∶1 600 可以检测出阳性，FPA 最高在血清稀释度1∶3 200 可以检测出阳性，具体结果见表4。

表4 SAT 与FPA 检测灵敏度的比较

3 讨 论

本文检测的样品主要来源于近几年本市域内未经布病疫苗免疫的规模养殖场、散养户的羊群，其中阳性血清151 份，阴性血清21 份，样品送检前进行了RBT 初筛。本市布病净化的手段主要是通过RBT 初筛，试管凝集确诊。 经过几年的努力，本市动物布鲁氏菌病的整体阳性率，已由2016 年的1.9%降至现在的0.4%[8]。

本次比较中发现，RBT 的符合率是这五种试验方法中最高的，为82.56%，其敏感性为100%，一致性高达82.56%，这也是RBT 一直被基层作为初筛的重要原因之一。 此外，RBT 操作简便，对技术人员要求不高，进行简单培训，就可以操作，几分钟就可以出结果，比较适合进行大批量样品的检测，但RBT 特异性比较低，因此该方法只适合样品的初筛[9]。

SAT 是我国诊断布鲁氏菌病的法定方法，所以本文以SAT 作为参考方法，该方法主要是检测IgM，敏感性较高，常用于布鲁氏菌病的早期诊断。 但SAT 单独使用时特异性比较低，结果需要通过肉眼观察来判定，受技术人员经验影响比较大，不能区分自然感染和人工免疫。此外，SAT 试验周期比较长，无法做到快速检测，试验操作相对较为繁琐，每个样品要做4 个稀释度，牛羊的血清稀释倍数不统一，这些无疑增加了技术人员的工作量。 SAT 试验对温度要求也比较高，要在37 ℃恒温箱中反应，不利于在田间或者没有相关恒温设备的基层实验室开展，一般县级及以上实验室才能开展。

FPA 试验结果表明，其特异性和准确率都比较高，不容易造成误诊。 FPA 试验整个操作过程比较简单，几分钟就可以得到检测结果，不需要长时间的等待和孵育、洗板、读板等工作。 但FPA 试验需要指定的检测仪器和检测试剂，价格比较昂贵，不适合在检测经费比较紧张、监测数量比较多的区县、乡镇推广，但可以根据实际情况，结合其他检测方法选择性使用。 据了解，FPA 试验在贸易口岸使用较为常见[10，11]。

ELISA 检测结果表明，cELISA 和iELISA 都具有较高的敏感性。而且，ELISA 操作简单，样本需求量不大，适合大批量检测[12]。 我区作为布病检疫净化区，每年检测数量都比较多，ELISA 检测方法就比较适合。同时，ELISA 检测结果比较客观，不会受技术人员的主观因素导致检测结果各异。但各乡镇由于技术人员水平和设备条件限制，且ELISA 检测的试剂费用相对也比较贵，无法在乡镇一级推广普及。

为了验证SAT 试验和FPA 试验的灵敏度， 本文将哈药集团的标准阳性血清按比例进行倍比稀释，SAT 最高在血清稀释度1∶1 600 可以检测出阳性，而FPA 在血清稀释度1∶3 200 依然可以检测出阳性。 实验结果表明，FPA 的灵敏度更高。 这样，在生产实践中，FPA 可以作为补充试验，对SAT 检测结果为阴性的情况下，可以使用FPA 进行再次验证。

4 结 论

综上所述，布鲁氏菌病血清学检测方法各有优缺点，而且由于客观条件的限制，每个层面的技术人员所能选择检测方法也比较局限，特别是越往基层，所能选择的检测方法越单一。这就导致很难对布鲁氏菌病血清学检测方法做出一个统一的选择。综合考虑，为了降低牛羊布鲁氏菌病传播的风险，应选取敏感性较高的检测方法，如乡镇可以选择RBT、市（区）县可以选择ELISA 等。 同时，为了减少养殖户的经济损失，与特异性较高的检测方法结合使用，如市（区）县可以选择SAT、市级单位可以选择SAT、FPA。 采用两种以上检测方法，不仅可以降低布鲁氏菌病的传播风险，减少养殖户的经济损失，还可以确保检测出结果的准确性，为检疫净化提供可靠保证。