基于AC/cAMP通路探讨清窦灵合剂对鼻窦炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白表达的影响

张田 喻国冻 顾平 唐强 金莹 (贵州医科大学附属医院耳鼻咽喉科,贵州 贵阳 550004)

鼻窦炎是从鼻窦黏膜发展的炎性的耳鼻喉科常见疾病,临床表现为鼻塞,流脓涕,头痛,眩晕,嗅觉障碍,记忆力下降等,伴有急性上呼吸道感染,在儿童及青少年中发病率极高,经常反复发作,甚至久治不愈〔1〕。目前关于该病的发病机制尚未完全阐明,因此尚无根治性治疗手段。我国中医药治疗手段在控制鼻窦炎症状方面效果显著。许多中成药如鼻窦炎口服液、鼻渊合剂、宣肺通窍颗粒等在临床上显示了良好的疗效〔2〕。清窦灵合剂主要由细辛、辛夷、苍耳子、黄芪、白术、白芷、防风、黄芩、川芎、薄荷、金银花等中药组成。李良波等〔3〕临床研究表明使用清窦灵合剂治疗儿童鼻-鼻窦炎效果良好,并且复发率较低,没有不良反应,但其中机制尚无报道。武楠等〔4〕研究报道甲基丁香酚(中药细辛的主要活性成分)通过调控水通道蛋白(AQP)5 的表达改善过敏性鼻炎大鼠的症状。研究表明〔5〕AQP 表达参与调控细胞内外的水平衡,直接维系细胞膜的通透性。研究表明〔6〕腺苷酸环化酶(AC)/环磷酸腺苷(cAMP) 通路是机体内介导水液代谢,细胞膜通透性的关键通路。但是未有AC/cAMP 通路对鼻黏膜上AQP 表达影响的报道。本研究通过建立鼻窦炎大鼠模型,从AC/cAMP 通路对鼻黏膜上AQP 蛋白表达的影响角度出发,探讨清窦灵合剂对鼻窦炎的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 10～12 周龄,SPF 级,雄性,SD 大鼠,体重200～220 g,共计60 只,从贵州省中观生物技术有限公司采购,许可证号:SCXK(黔)2018-0004。

1.2 主要试剂和仪器 清窦灵合剂(贵州医科大学附属医院制剂室生产,批号为: H20160467);青霉素V 钾片(0.236 g×30 片,西南药业股份有限公司,批号为:国药准字H20067446)。免疫组化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司,蛋白浓度测定试剂盒购自南京建成生物有限公司,磷酸化蛋白激酶(p-PK)A、磷酸化环磷酸腺苷及应单元结合蛋白(p-CREB)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,苏木素-伊红(HE)染色试剂盒采购自美国Cell Signaling 公司, Western 印迹试剂盒购自美国BIORAD 公司。倒置荧光显微镜(日本Olympus 公司);凝胶成像仪(美国Beckma 公司);小型台式离心机(北京六一公司);小微动物全自动生化仪(美国BIO-RAD 公司);生物超净工作台(上海医疗器械制造厂)。

1.3 模型构建和分组处理 实验大鼠在医院的饲养房标准条件下适应性生活1 w 后开始实验。将大鼠随机分为正常组、模型组、实验组、对照组,每组15 只;参照文献〔7〕建立急性鼻窦炎大鼠模型:将大鼠全身麻醉后,使用2.0 ml(20 mg/ml)利多卡因联合0.012 5 mg 肾上腺素,在鼻背下浸润麻醉,同时在大鼠面中线上中1/3 交界处以45°做切口,将含有0.1 ml(1×109U/L)金黄色葡萄球菌的明胶海绵塞入切口,消毒后缝合切口。造模成功标准:以大鼠术后3 d 不喜运动,饮食量日益减少,术后第4 天大鼠出现搔鼻动作,稍见喷嚏现象,5 d 后较正常大鼠运动明显减少,鼻腔内出现清涕,鼻潜艇潮红,出现搔鼻、喷嚏等症状,视为造模成功〔7〕。实验组和对照组每日分别以10 ml(20 mg/ml)清窦灵合剂和青霉素V 钾灌胃给药,正常组和模型组每日以等剂量生理盐水进行灌胃处理,1 次/d,连续给药7 d。

1.4 大鼠鼻部症状评分 连续给药7 d 后,对大鼠鼻部症状进行评分,评分标准如下〔8〕:30 min 内搔鼻(1～4 次)或30 min 内喷嚏(1～4 个)或鼻腔内有少量流涕或鼻腔充血,轻度症状计为1 分;30 min内搔鼻(5～9 次)或喷嚏(5～9 个)或鼻腔内有较多流涕或鼻腔红肿,中度症状计为2 分;30 min 内搔鼻(≥10 次)或30 min 内喷嚏(≥10 个)或鼻腔内附着分泌物或鼻腔红肿出血,重度症状计为3 分。

1.5 收集血清标本及生化检测其血清标本中的白细胞计数 在连续给药7 d 后,经尾静脉收集各组静脉血,离心后获得血清,生化检测自动仪测定。

1.6 ELISA 检测血清中AC、cAMP 水平 严格按试剂盒要求进行操作,使用多功能酶标仪进行分析。

1.7 HE 染色观察鼻黏膜组织的组织病理学改变留取血清后,处死大鼠,在显微镜下佩戴无菌手套,收集鼻黏膜组织,并进行液氮封存;取出10%鼻黏膜组织,以多聚甲醛固定,常规切片后HE 染色,显微镜下观察鼻黏膜病理改变。参照文献〔9〕采用的评分方法,对大鼠鼻黏膜损伤程度进行评价,评分标准为:0 分:无损伤,无病变;1 分:轻度损伤,鼻黏膜上皮轻度水肿,稍见缺损;2 分:中度损伤,黏膜充血水肿较重,部分纤毛弯曲,纤毛排列凌乱,较多的炎性细胞浸润;3 分:重度损伤,黏膜上皮缺损严重,坏死严重,出血点较多,纤毛倒伏严重,炎性细胞大量浸润。

1.8 电镜观察鼻黏膜组织的超微结构改变 从冰箱中取出10%各组大鼠的鼻黏膜组织,分别制成0.3 cm×0.5 cm 大小的超薄组织切片:采用2.5%戊二醛固定8 h,生理盐水清洗3 次,梯度浓度乙醇脱水,维持-20℃冷冻干燥过夜,扫描和透射电镜下观察鼻黏膜组织超微病理结构改变

1.9 免疫组化检测鼻黏膜组织AQP1 和AQP5 的水平 从冰箱中取出20%大鼠肝组织,常规固定,脱水,浸蜡,包埋,切片,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后,鸡蛋清于37℃下封闭,加入一抗(1 ∶100),4℃孵育过夜,次日加入二抗(1 ∶200),PBS 冲洗后,苏木素复染,封片。显微镜下观察结果。Image Pro Plus8.0 软件进行图像统计分析。

1.10 Western 印迹检测鼻黏膜组织中p-PKA、p-CREB 的表达 从冰箱中取出10%大鼠肝组织,裂解,离心(13 000 r/min,4 ℃,10 min),留取上清,测定浓度后,电泳,转膜,鸡蛋清封闭,滴加一抗(1 ∶100),4℃孵育过夜,加入二抗(1 ∶100),PBS 冲洗,显色,凝胶成像仪下读取各条带的灰度值。

1.11 统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 各组鼻部症状的评分及血清中白细胞计数比较 与正常组相比,模型组鼻部症状评分和白细胞计数明显升高(P＜0.05);与模型组相比,实验组、对照组鼻部症状评分和白细胞计数明显降低(P＜0.05),实验组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

2.2 各组血清中AC、cAMP 的水平比较 与正常组相比,模型组血清中AC、cAMP 的水平明显升高(P＜0.05);与模型组相比,实验组、对照组血清中AC、cAMP 水平明显降低(P＜0.05),实验组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

2.3 各组鼻黏膜组织病理改变 正常组鼻黏膜组织结构完整,纤毛上皮连续,细胞排列整齐,未见水肿,充血,缺损,炎性浸润;与正常组相比,模型组呈现典型的炎性改变,鼻黏膜上皮充血,肿胀明显,细胞排列紊乱,大量炎性因子浸润,鼻黏膜损伤病理评分明显升高(P＜0.05);与模型组相比,实验组和对照组鼻黏膜损伤明显缓解,上皮细胞稍见肿胀,充血点明显减少,稍见缺损,炎性细胞浸润数量明显减少,大部分黏膜趋于正常,鼻黏膜损伤病理评分明显下降(P＜0.05)。实验组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

2.4 电镜观察各组鼻黏膜组织的超微结构改变正常组鼻黏膜结构正常,黏膜纤毛密集排列,且整齐均匀,摆动规律,数量丰富,纤毛直径及纤毛长度均一,未见异常。模型组鼻黏膜纤毛或缺失,或排列散乱,纤毛顶端黏连成簇,摆动无规则,中央微管融合或缺失严重,纤毛膜缺损严重,较多纤毛出现脱落现象。实验组和对照组鼻黏膜纤毛脱落明显减轻,纤毛膜较为完整,中央微管结构清晰,趋于完整,偶见粘连,见图1。

图1 透射电镜观察各组鼻黏膜超微结构改变(× 12 000)

2.5 免疫组化检测各组鼻黏膜组织中AQP1 和AQP5 的表达 与正常组相比,模型组鼻黏膜组织中AQP1 表达明显增强,AQP5 表达明显下降(P＜0.05);与模型组相比,实验组和对照组鼻黏膜组织中AQP1 表达明显下降,AQP5 的表达明显增强(P＜0.05),实验组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05),见表1、图2。

表1 各组鼻部症状评分及血清中白细胞计数、AC、cAMP、鼻黏膜损伤评分及AQP1、AQP5 表达的免疫荧光强度相对值(±s,n=15)

表1 各组鼻部症状评分及血清中白细胞计数、AC、cAMP、鼻黏膜损伤评分及AQP1、AQP5 表达的免疫荧光强度相对值(±s,n=15)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;表2 同

组别鼻部症状评分(分)白细胞计数(×105 U/L)AC(μg/L)cAMP(μg/L)鼻黏膜损伤评分(分)AQP1AQP5正常组1.83±0.624.02±0.5530.51±1.243.64±0.830.22±0.17100.04±1.1199.36±1.25模型组7.85±2.961)8.69±1.071)53.57±2.681)22.67±2.071)2.53±0.341)623.65±25.361) 19.95±2.161)实验组6.24±1.632)6.28±0.862)42.08±1.652)12.53±2.282)1.97±0.212)245.59±18.622) 64.38±5.642)对照组6.27±1.592)6.31±0.772)42.15±1.592)12.61±2.192)1.99±0.182)247.07±16.252) 63.53±5.722)

图2 免疫组化检测各组鼻黏膜组织中AQP1、AQP5 的表达(× 400)

2.6 Western 印迹检测各组鼻黏膜组织中p-PKA、p-CREB 的表达 与正常组相比,模型组鼻黏膜组织p-PKA、p-CREB 表达明显升高(P＜0.05);和模型组相比,实验组和对照组鼻黏膜组织p-PKA、p-CREB 表达明显降低(P＜0.05)。实验组和对照组蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05),见图3、表2。

表2 各组鼻黏膜组织p-PKA、p-CREB 的相对表达(±s,n=15)

表2 各组鼻黏膜组织p-PKA、p-CREB 的相对表达(±s,n=15)

组别AQP1AQP5正常组0.92±0.091.00±0.05模型组7.75±0.271)4.59±0.351)实验组2.26±0.372)2.24±0.212)对照组2.32±0.282)2.28±0.162)

图3 Western 印迹法检测各组鼻黏膜组织中p-PKA、p-CREB 的表达

3 讨 论

鼻窦炎是累及上颌窦、筛窦、额窦和蝶窦等部位炎性疾病,属于常见耳鼻喉科疾病,易发于各种人群。临床上以鼻塞,头痛,流脓涕为主要症状。如果不能及时控制症状,易引发中耳炎、上颌骨髓炎、脑膜炎等重症并发症。

鼻窦炎在中医上属于“鼻渊”范畴,在针对鼻窦炎的治疗方面,中医药从辩证角度出发,针对患者进行个体化治疗,多种治疗手段并行,并且其副作用小,疗效稳定,展示了独特的优势〔10,11〕。潘庆春等〔12〕研究证实采用温针灸联合通窍鼻炎方治疗慢性鼻窦炎后,能明显改善患者生活质量,降低鼻部炎性反应,提高临床疗效。姚期等〔13〕研究表明健脾化浊通窍汤针对难治性慢性-鼻-鼻窦炎具有良好的临床治疗效果。清窦灵合剂是在中医思想指导下由细辛、辛夷等10 余味中药组成的传统方剂。李良波等〔14〕通过临床研究报道清窦灵合剂在促进鼻黏膜纤毛功能早期恢复,缓解患者症状,减轻患者鼻腔上皮水肿,减少肉芽形成方面疗效显著。

研究表明〔15〕AQP 是一类细胞膜上负责水的分泌与吸收的进化高度保守的蛋白分子,是水分子进出细胞的主要通道,是维系细胞内外水平衡的关键因子。研究显示〔16〕AQP1,AQP5 等在鼻腔黏膜中的表达与鼻腔的分泌行为关系密切。黎桥等〔17〕研究证实下调AQP1,AQP5 的表达能明显缓解变应性大鼠的流脓涕,挠鼻及喷嚏等症状。AC/cAMP 通路是外界刺激因子与细胞内信号分子在细胞膜表面进行转换的关键通路〔18〕。研究表明〔19〕在应激条件下,三磷酸腺苷在AC 的作用下生成第二信使cAMP,cAMP 促使PKA 磷酸化。PKA 活化后,一方面p-PKA 可直接作用于AQP 的氨基酸序列而调节AQP表达,另一方面〔20〕p-PKA 进入胞核,激活CREB,使CREB 发生磷酸化,将信号入核,影响相关基因以及转录子的表达,调控AQP 的表达。Chen 等〔21〕研究证实抑制AC/cAMP 通路能明显抑制AQP 表达,改善胆固醇结石小鼠胆细胞的细胞膜通透性。Chang等〔22〕研究表明抑制人鼻上皮细胞上的AC/cAMP 的表达,能明显上调AQP5 表达,缓解人鼻上皮细胞的水肿状况。清窦灵合剂的治疗作用可能与抑制AC/cAMP 通路,调控AQP1,AQP5 表达有关。