绝经后妇女维生素B相关基因3′-UTR多态性与骨质疏松和骨质疏松性椎体压缩骨折的相关性分析

刘珂，刘远

(1.北京广外社区卫生服务中心，北京 100055；2.淮安市第二人民医院，江苏淮安 223000)

既往研究显示，年龄、吸烟、饮酒、类固醇应用、高同型半胱氨酸血症、维生素缺乏等与骨质疏松和骨质疏松性椎体压缩骨折(Osteoporotic vertebral compression fractures,OVCF)相关[1-2]。越来越多的证据表明，高水平的同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)可产生过量自由基，增强氧化应激反应，促进破骨细胞活性和骨吸收，抑制骨形成，加速骨量丢失和骨质疏松形成[3]。维生素也与骨骼健康密切相关，维生素B6、B9(叶酸)和B12(甲钴胺)缺乏会导致血清Hcy水平升高。研究显示，甲钴胺可促进成骨细胞增殖，甲钴胺缺乏可通过提高Hcy和甲羟甲基丙烯酸水平，增加破骨细胞形成[4]。维生素B1(硫胺素)可能抑制核因子κb配体诱导的破骨细胞生成的受体激活剂，维生素B1缺乏可能与骨健康不良之间存在联系[5]。虽然维生素B在骨代谢中发挥重要作用，但维生素B相关基因多态性与骨质疏松之间的关系研究较少见报道。本研究选择4种已知与B族维生素相关的基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，包括TCN2(编码TCⅡ)、CD320(编码TCⅡ受体)、SLC19A1(编码RFC1)和SLC19A2(编码硫胺素载体1)，探讨这4种单核苷酸多态性与本地绝经后妇女骨质疏松症和OVCF的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性病例对照研究，研究符合《赫尔辛基宣言》原则，本院伦理委员会批准本研究，所有受试者均签署知情同意书。选择2020年1月～2021年3月在本院就诊的绝经后骨质疏松症患者157例(其中OVCF61例)作为研究组，所有患者均符合以下标准：①末次月经距今来访日期>1年，或自发性闭经6个月伴血清FSH水平>40 mIU/mL，符合绝经的诊断标准；②双能X线骨密度仪检测骨密度T值<-2.5，符合骨质疏松的诊断标准，患者伴或不伴影像学诊断的OVCF；③患者对研究知情并签署同意书。选择同期在本院健康体检的非骨质疏松绝经后妇女157例作为对照组，所有受试者腰部和髋部T值>-1.0，患者无脊柱或髋部骨折。两组受试者均排除：①合并弥漫性特发性骨质增生、脑垂体疾病、类风湿性关节炎、甲状腺功能亢进等代谢性疾病；②近期口服抗凝剂、避孕药、激素替代疗法、类固醇激素、钙、维生素D或维生素B等影响骨代谢的药物者；③血清阴性脊柱关节病；④脑卒中或缺血性心脏病；⑤癌症患者或外籍患者；⑥精神疾病患者或严重认知功能障碍者。研究组受试者年龄54～79岁，平均(68.73±6.45)岁；体质量指数(22.46±2.85)kg/m2；对照组受试者年龄52～79岁，平均(68.94±6.08)岁；体质量指数(22.58±2.64)kg/m2。两组受试者年龄、体质量指数差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

收集受试者5mL外周血，离心分离白细胞后，采用G-DEXIIb基因组DNA提取试剂盒(江莱生物)提取基因组DNA，用聚合酶链反应和限制性片段呈现基因多态性(PCR-RFLP)对CD320 rs9426 C>T、TCN2 rs10418 C>T、SLC19A1 rs1051296 G>T和SLC19A2 rs16862199C>T的3’-UTR多态性进行基因分型(见图1)。使用PrimerQuest设计引物序列：CD320 rs9426 C>T：正向：5’-TGTCTTAAGCACAGGGCCGTTCTA-3’，反向：5’-GGTCCCTGGACACTCCCCATG-3’；TCN2 rs10418 C>T，正向：5’-ACTCTGTTAGAGTGGCAGATC-3’，反向：5’-GCTTTAATTTTGTCAGAGGCAGG-3’；SLC19A1 rs1051296 G>T：5’-GCTTCTCTGTCTCTGTGGAAA-3’，反向：5’-AAGCCTGGCACATACCAA-3’；SLC19A2 rs16862199 C>T：正向：5’-GCAGGAATCACATCTATCCTAGTTCC-3’，反向：5’-GCTTAAGGTACGCTTGCTTGTC-3’。

图1 限制性片段程度多态性随基因型的变化(A示：CD320 rs9426 C>T；B示：TCN2 rs 10418 C>T；C示：SLC19A1 rs1051296 G>T；D示：SLC19A2 rs16862199 A>G)

1.3 其他临床资料收集

包括血糖、血Hcy、叶酸、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-C,HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-C,LDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)、维生素B12等血清学指标，以及骨密度(bone mineral density,BMD)、体质量指数(body mass index,BMI)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、收缩压(systolicbloodpressure,SBP)等指标。血糖、HDL-C、LDL-C、TG等采用全自动生化仪检测，采用荧光偏振免疫测定法测定Hcy，采用竞争免疫测定法检测叶酸水平，使用Bio-Rad Quataphase Ⅱ放射测定法检测维生素B12水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律的吻合度检验

2.2 两组受试者基因型比较

两组受试者CD320 rs9426 SNP存在统计学差异(P<0.05)，TCN2 rs 10418、SLC19A1 rs 1051296、SLC19A2 rs16862199 SNP差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组受试者4种维生素B相关基因基因型比较(例)

2.3 四个SNP的等位基因组合与骨质疏松和OVCF的关系

采用MDR方法分析四个SNP的等位基因频率(顺序为CD320 rs9426、TCN2 rs 10418、SLC19A1 rs 1051296、SLC19A2 rs16862199，见表2)，有两个等位基因综合在对照组和研究组之间存在显著差异，分别是C-T-T-C和T-C-G-C(P<0.05)；5个等位基因在对照组和OVCF组之间存在显著差异，分别是C-C-G-T、C-C-T-C、C-C-T-T、C-T-T-C和T-C-G-C(P<0.05)；3个等位基因在对照组和非OVCF研究组患者之间存在显著差异，分别是C-T-G-C、C-T-G-T和C-T-T-C(P<0.05)。见表2。

表2 四个SNP的等位基因组合与骨质疏松和OVCF的关系

3 讨论

新的证据表明，B族维生素特别是维生素B1、甲钴胺和叶酸对骨骼有保护作用，而同型半胱氨酸对骨骼健康有不利影响[6]。既往研究已经证实，叶酸、维生素B12、维生素B6和维生素B2均参与了Hcy代谢[7]。因此，叶酸和维生素B12缺乏可能导致血清同型半胱氨酸水平升高，从而导致骨质疏松和OVCF。钴胺素首先与钴胺素转运蛋白(transcobalamin II,TCⅡ)复合，然后TCⅡ-钴胺素复合物通过细胞表面TCⅡ受体(CD320基因编码)的相互作用进入细胞[8]。硫胺和叶酸可分别通过硫胺载体1(TC1，由SLC19A2编码)和还原叶酸载体(由SLC19A1编码)转运到细胞中[9]。B族维生素状态与直接参与维生素吸收/摄取(CD320)或转运(TCN2、SLC19A1、SLC19A2)基因中的SNP有关，这些基因中的SNP可通过维生素的个体作用及其对Hcy浓度的影响，对骨健康产生有害作用。

本研究探讨了位于CD320、TCN2、SLC19A1和SLC19A2基因3’-UTR的SNP与绝经后妇女骨质疏松症和OVCF之间的可能关联。本研究的主要结果包括：①CD320 CT+TT在绝经后骨质疏松症患者中发生率显著升高，提示CD320 CT+TT可能与绝经后妇女的骨质疏松发生相关；②C(CD320)-T(TCN2)-T(SLC19A1)-C(SLC19A2)和T(CD320)-C(TCN2)-G(SLC19A1)-C(SLC19A2)等位基因组合与骨质疏松风险显著增加相关；③C-C-G-T、C-C-T-C、C-C-T-T、C-T-T-C和T-C-G-C等5个等位基因组合与OVCF风险显著增加相关。既往研究显示，与非骨质疏松患者相比，骨质疏松患者尤其是OVCF患者表现为更高水平的叶酸和高Hcy水平。本研究结果强调了影响同型半胱氨酸水平的B族维生素基因型与骨质疏松和OVCF发病率的关系。

总体而言，本研究表明，在携带基因型CD320-CT+TT和多个基因组合型的患者中，骨质疏松症和OVCF发生率显著增加。Stone等[10]研究显示，miR-126结合位点的SNP与总Hcy水平升高和甲基丙二酸水平显著相关。来自BPROOF研究的横断面研究显示，女性Hcy水平升高与骨超声参数之间呈显著负相关[11]。Hcy可能会阻碍骨内胶原交联的形成，从而以独立于骨密度的方式降低骨强度。Yang等[12]研究显示，一般人群中的血清Hcy水平轻微上升即与脊柱和髋部骨折风险增加相关。DNA甲基化在基因表达调控中发挥重要作用，蛋氨酸向Hcy转化涉及到一个甲基去除，高水平的Hcy可抑制这种转化，降低DNA甲基化活性和改变基因表达，从而影响CD320基因表达。等位基因-等位基因组合分析显示，不同基因综合与骨质疏松和OVCF风险增加相关，提示可能存在基因-基因相互作用，这一点需要进一步研究探讨。

综上所述，本研究显示，3′-UTR中CD320基因的单核苷酸多态性可能与绝经后女性骨质疏松及OVCF的发生有关，CD320、TCN2、SLC19A1和SLC19A2的特定等位基因组合可能增加骨质疏松症和OVCF的易感性。