皇藏峪国家森林公园及其周边可培养酵母资源的调查

孙 勇, 张艺嘉, 崔娴秋, 蒋继宏

(江苏师范大学 生命科学学院,江苏 徐州 221116)

森林资源的良好发展对微生物生态的维持有重要作用,同时,良好的微生态环境对树木的生长也有反哺作用.皇藏峪国家森林公园是中国最大的古树群落景区之一,有同纬度保存较完好的落叶阔叶林带,以青檀树、侧柏、刺槐、橡树、泡桐、栎树、瓜子黄杨、银杏、南京椴、五角枫、黄连木、青桐、山杏、酸枣、豆梨、樱桃、石榴等为主.周边其他山林也较多,如龙岗山、塔山和龙脊山等山上植被繁茂.这些地区人员流动较少,工业欠发达,人类活动对其生态环境破坏极少.皇藏峪地区呈现喀斯特地貌特征,属于季风气候,其环境湿润,四季变化明显,果树丛多,是调查野生酵母菌等微生物资源的良好场所.

酵母菌是十分重要的单细胞真核微生物,与人类的生活、生产密切相关,在农业生产、食品防腐保鲜、工业发酵、化工原材料制备和医药等方面有着广泛的应用,例如：拮抗酵母菌可用于防治果蔬采摘后的病害,延长果蔬保鲜时间[1-4];布拉氏酵母菌对黄疸患儿有明显疗效[5];在人和动物的肠道中,酵母菌可分泌抑菌性物质和诱导宿主产生抗性,发挥对致病菌和条件致病菌的拮抗作用,促进优势种群生长,调整微生态平衡[6];酵母菌也可用于水处理,且处理后的剩余污泥中富含蛋白质和多种氨基酸等[7-10].

近年来,我们多次在皇藏峪国家森林公园及其周边地区采集植物样品,包括野桃树、山杏、橡树、侧柏、豆梨和石榴等,作为分离酵母菌的材料.基于酵母单细胞特性和细胞大小范围,对传统的酵母菌分离方法进行了改进,分离的酵母菌株通过26S rDNA D1/D2区序列比对进行初步鉴定,对不同树种可培养酵母菌种类进行了分析,为皇藏峪国家森林公园原生态环境质量以及酵母多样性研究提供理论参考,为酵母菌的开发应用提供资源保障.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器及设备超净工作台(苏州净化);Mupid-exu电泳仪(日本Mupid);Gel Doc RF凝胶成像系统(美国Bio-Rad);TP600型基因扩增仪(日本Takara);D3024台式高速微量离心机(美国Scilogex);DHP-9025电热恒温箱(上海坤诚);LDZX-50KBS高压灭菌锅器(上海申安).

1.1.2 培养基YPD液体培养基:葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸馏水1 L.PDA培养基:土豆200 g,蔗糖20 g,蒸馏水1 L,琼脂粉20 g.

1.2 方法

1.2.1 样品采集采样点位于安徽省宿州市北部的皇藏峪国家森林公园及其周边的龙岗山、塔山和龙脊山等山林,见图1(地图来自https://ditu.cncn.com/huaibei).植物样品为桃、杏、石榴、豆梨掉落的腐烂果实，麻栎掉落的腐烂坚果和侧柏的果实等有机质丰富的材料,同一采样点至少采集3个样品,树种复杂的采样点相应增加样品数量.采集样品时佩戴手套,采集后的样品置于信封袋中.为防止交叉,每种样品一个信封袋,按采样点编号,记录样品名称、海拔高度、经纬度等信息,方便后续在实验室中进行酵母菌株分离.

图1 样品采集点分布图Fig.1 Distribution map of sample collection points

1.2.2 酵母菌的分离和纯化参照并改进文献[11]的方法进行酵母菌株的分离和纯化:根据样品数量准备无菌的50 mL离心管备用,每个离心管中加入含氯霉素(终浓度为100 μg/mL)的10 mL YPD液体培养基.将样品分别切成边长约2 mm的方块,各取0.5 g放入各自的离心管中,150 r/min摇床上震荡培养12 h,培养温度25 ℃.取出扩大培养的样品,用无菌注射器吸取5 mL发酵液,先用10 μm孔径的无菌滤膜过滤器过滤培养液,去除丝状真菌和杂质(残留在滤膜上),再用3 μm孔径的无菌滤膜过滤滤液(酵母大部分留在滤膜上)，后弃掉滤液,用无菌水反复冲洗滤膜以减少细菌数量.取下滤膜置于无菌平板上,用无菌水再次反复冲洗滤膜,冲洗液用1.5 mL的离心管收集,显微镜下观察和估算酵母菌数量,然后10倍梯度稀释2次.从不同梯度的稀释液中各取100 μL,按先稀后浓的顺序涂布于倒好的PDA平板培养基上,置于25 ℃恒温培养箱中培养,每天查看1次菌落的生长状态,连续查看2 d.菌落长出后,用无菌枪头蘸取需要进一步培养的菌落,采用四区划线法在PDA平板培养基上进一步纯化.纯化得到的菌株接种到YPD液体培养基中,在28 ℃摇床上培养3 d后,用菌液与质量浓度为40%的甘油按体积比1∶1混合后冷冻保藏(-80 ℃).鉴定后的菌株,交由保藏中心用液氮和冷冻干燥等方法进行永久或长效保藏.

1.2.3 酵母菌株DNA的提取菌株纯化后,挑取芝麻粒大小的菌体,置于1.5 mL的无菌离心管中,-20 ℃冰冻2 h后，立即加入质量浓度为2%的CTAB 200 μL,再加入1/2体积的石英砂，离心管置于65 ℃的水浴锅中温浴1.5 h，加入PCI混合溶液(VTris-饱和酚∶V氯仿∶V异戊醇=25∶24∶1),剧烈震荡1 min后,10 000 r/min离心10 min.吸取100 μL上清液移至新的离心管中,加入100 μL异丙醇,混匀,-20 ℃下孵育2 h,沉淀DNA.10 000 r/min离心10 min后,去上清液,沉淀用体积分数为75%的乙醇洗涤后,置于超净工作台上自然干燥,使用30 μL去离子水溶解提取到的DNA,置于-4 ℃冰箱中保存备用[12].

1.2.4 酵母菌26S rDNA D1/D2区序列扩增及测序选择酵母菌通用扩增引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)进行酵母菌株的26S rDNA D1/D2区序列扩增[13].

PCR的反应条件为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性20 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,循环35次;72 ℃延伸10 min.扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,制备质量浓度为1%的琼脂糖凝胶,每孔上样量为5 μL,150 V电压下电泳20 min后EB染色,在UV凝胶成像系统下观察并记录,好的扩增产物条带单一且清晰,大小约为600 bp,剩余的扩增产物送往上海生工生物技术公司测序.测序结果在Chromas软件中分析数据的可靠性,用Editseq软件打开序列数据,将序列在NCBI网站上进行比对,对比结果及序列合并保存.

1.2.5 菌株系统树的构建用软件MEGA 6.0将每一个样品分离的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2区序列进行聚类，用邻接法构建系统发育树，在发育树中显示菌株分离鉴定结果和菌株重复数量.

2 结果与分析

2.1 酵母的分离效果

与传统分离方法(图2A、B)相比，改进的酵母菌分离方法增加了2次过滤步骤,处理后的平板培养状态如图2C、D所示.酵母菌的细胞浓度可以随机调节,涂布的平板上酵母菌落生长密集,数量和种类较多,细菌菌落占比极少(酵母菌落和细菌菌落可通过质地、透光度和细胞大小分辨),丝状真菌极少或没有,即除单细胞的酵母菌外,扩张很快的丝状杂菌对酵母菌的生长和后期纯化影响极小.可见，改进的分离方法排除了细菌和丝状真菌对酵母菌的干扰,有利于延长分离平板的培养时间及鉴别、挑选酵母菌株,提高获得酵母纯菌株的几率.

A.不过滤分离(原液); B.不过滤分离(稀释10倍); C.2次过滤(原液); D.2次过滤(稀释10倍).图2 分离平板上的菌落情况Fig.2 Colonies on the separation plate

2.2 同一采样点可培养酵母种群分析

采样点2以北纬117°4′10″,东经34°1′47″为中心,面积约0.2 km2,地形为两面山坡围成的山峪,从北向南海拔逐渐升高,海拔高度为60～300 m;主要以侧柏林为主,点缀几片小桃林和零星的杏树、洋槐等.采集侧柏成熟球果、腐烂桃果和杏果作为酵母菌株的分离材料,分离后获得的酵母菌株进一步纯化保存.以这些菌株的DNA为模板,进行26S rDNA D1/D2区序列扩增获得PCR产物,测序结果在NCBI网站上比对,所有样品的鉴定结果见系统发育树(图3—5).

每行依次为菌株号、种名、最高相似度、重复鉴定菌株数.疑似新种菌株号加粗.下同.图3 桃果分离获得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2区序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from peach fruit

图4 杏果分离获得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2区序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from apricot fruit

图5 侧柏样品分离获得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2区序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from platycladus orientalis

桃果样品2个(编号A、T)，共鉴定酵母菌株39株，20个种，分属于Papiliotrema、Kwoniella、Meyerozyma、Wickerhamomyces、Rhodotorula等18个酵母属，其中Papiliotremaflavescens和Kwoniellabestiolae菌株重复较多，2个分离样品共有交叉重复的菌株19株，仅4个种，表明同一树种重复分离是必要的；从桃果样品获得了5个潜在新种，分别为Anhui A25(Tremellasp.)，Anhui A6和Anhui T8(Vishniacozymasp.)，Anhui T17(Cystofilobasidiumsp.)，Anhui T6和Anhui A22(Colacogloeasp.)，Anhui A20(Hamamotoasp.)(图3).

杏果样品2个(编号B、X)，共鉴定酵母菌株24株，10个种，分属于Papiliotrema、Kwoniella、Vishniacozyma、Filobasidium、Curvibasidium、Sporidiobolus、Colacogloea、Hanseniaspora、Wickerhamomyces9个酵母属，其中Vishniacozymatephrensis、Kwoniellabestiolae和Filobasidiummagnum重复菌株较多，2个分离样品共有交叉重复的菌株15株，属于4个种；另外,发现3个潜在新种，其中2个新种在桃树上也分离到.与在桃树上分离的酵母菌种相同的为Papiliotremaflavescens、Kwoniellabestiolae、Colacogloeasp.和Vishniacozymasp. 4个菌种(图4).

侧柏球果样品1个(编号S),共获得酵母菌株33株,鉴定为16个种,分属于Aureobasidium、Bullera、Curvibasidium、Vishniacozyma、Papiliotrema、Sporidiobolus、Rhodosporidiobolus、Tremella、Hannaella、Pseudotremella10个酵母属,其中Aureobasidiumnamibiae和Curvibasidiumpallidicorallinum重复菌株较多;另外，获得3个潜在新种(图5).

该采样点共分离鉴定了酵母菌株96株,归属于25个属,36个种,7个种为潜在新菌种,新种获得率较高.不同的树种材料分离的酵母菌株中,优势菌种存在差异,36种酵母菌中,桃树独有的菌种12个,杏树独有的5个,侧柏独有的9个,桃和杏有4个种相同,桃和侧柏有4个种相同,杏和侧柏有3个种相同,3种植物共有的有2个种(Papiliotremaflavescens和Vishniacozymasp.).这表明,即使是在同一区域,不同树种上的酵母菌种类也存在较大差别.

2.3 皇藏峪国家森林公园及其周边区域酵母菌种的初步调查

在皇藏峪国家森林公园内以北纬117°4′10″、东经34°1′47″为中心设置1个采样点，在其周围的龙岗山(北纬117°3′20″,东经34°2′2″)、塔山(北纬116°59′50″,东经33°55′41″)和龙脊山(北纬116°28′48″,东经33°54′48″)等地设置6个采样点(图1).采集的样品来自杏、豆梨、橡树、桃、石榴等植物,分离获得了562株酵母菌株,对其中的216株菌株进行26S rDNA D1/D2区序列测序,在NCBI网站上比对，分类鉴定结果见表1.鉴定的216株酵母菌株归属于37个属,68个种(子囊菌酵母25种,担子菌酵母43种);潜在新种11个,分属于子囊菌的Metschnikowia属和Wickerhamomyces属,担子菌的Cryptococcus属、Tremella属、Cystofilobasidium属、Rhodotorula属、Fibulobasidium属、Vishniacozyma属、Colacogloea属和Hamamotoa属,潜在新种占16.2%.

表1 皇藏峪国家森林公园及其周边的酵母种类Tab.1 Yeast species isolated from Huangcangyu National Forest Park and its surroundings areas

3 讨论

通常,分离酵母菌的方法包括样品的处理、酵母富集培养、梯度稀释后涂布分离、酵母的挑选和纯化[11,14-15].富集培养主要利用的是培养基差异和加入抗生素来抑制酵母菌外的微生物生长,这种分离方法对细菌的抑制程度小,部分细菌具有抗药性,会和酵母菌一起生长,影响酵母单菌落的生长和后期的分离纯化.丝状真菌如没有去除措施,其快速扩展会导致酵母菌落还未表现出个体差异就被丝状真菌覆盖，影响后期酵母菌落的挑选和纯化.本研究改进的分离方法增加了2步过滤步骤：样品富集培养时,丝状真菌的孢子已经变成菌丝,通过10 μm滤膜去除,较好地解决了丝状真菌的干扰;3 μm滤膜的过滤及多次冲洗可以去除大部分的细菌.值得注意的是,使用这种方法过滤时样品要干净,且不能过碎,否则不易过滤;滤液量少而稀才能发挥滤膜的选择作用.

影响酵母菌种调查的因素很多,除同一区域不同树种分离的酵母不同外,不同区域同一树种分离的酵母菌种类也存在差异.培养法是获取微生物资源、用于实际应用的主要途径,能部分反映取样地区微生物的丰富度,经过分离和培养过程,平板上获得的菌株数量与实际情况会有较大差异,主要表现在分离中的富集培养基中富集培养时,不同的菌株生长和分裂速度不一样,导致分析结果与事实可能不一致;另外,挑取菌落用于鉴定时,带有一定的人为主观因素,菌株重复或不全面与挑菌人员的知识储备有很大关系.因此，培养法仅能调查到一个地区酵母菌的部分种类.我们仅对皇藏峪国家森林公园部分植物进行了调查，从目前分离和鉴定的结果看,分离到37个属，68个种及潜在新种11个，表明该地区酵母多样性非常丰富,值得进一步采样分离,获取菌种资源,从而为后续的酵母菌功能研究及酵母菌资源开发与利用奠定基础.